我們知道，RNAi是從mRNA水平對目的基因進(jìn)行沉默，而CRISPR-Cas9是從基因組水平對目的基因進(jìn)行敲除或消除目的基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，讓靶蛋白的功能下調(diào)或完全喪失，Cas9靶點(diǎn)的選擇范圍相比RNAi也更加廣泛，包括所有基因組序列，如外顯子、內(nèi)含子、啟動子、增強(qiáng)子、基因間隔序列等。2019年國家自然科學(xué)基金以CRISPR為關(guān)鍵詞的項目資助金額達(dá)到3485萬元，伴隨CRISPR體系的不斷優(yōu)化與應(yīng)用深入，CRISPR-Cas9也逐漸成為越來越普遍的基因功能研究工具而進(jìn)入更多實(shí)驗室。關(guān)于全RNA體系的CRISPR-Cas9工具在眾多CRISPR-Cas9基因編輯工具中，全RNA體系的CRISPR-Cas9由于不需要構(gòu)建質(zhì)粒或包病毒載體，一次可同時靶向編輯更多目的基因，細(xì)胞毒性小，操作難度大大降低，準(zhǔn)備工作更少，周期更短，同時性價比更高，實(shí)驗環(huán)境更為友好，極大地降低了基因編輯技術(shù)的門檻和實(shí)驗復(fù)雜程度，提高了實(shí)驗的成功率和普及率。所謂全RNA體系，就是CRISPR-Cas9采用天然復(fù)合物系統(tǒng)（crRNA與tracrRNA）和Cas9 mRNA，其中Cas9 mRNA直接在細(xì)胞內(nèi)瞬時表達(dá)Cas9蛋白，無任何DNA組分或其他表達(dá)元件，組成一個即用型體系，同時經(jīng)專利技術(shù)優(yōu)化以實(shí)現(xiàn)真正高效簡單地編輯。今天小編就以銳博生物的CRISPR-Cas9體系（中國專利號:108977442A/PCT申請?zhí)?CN2018/088105），為大家詳細(xì)介紹全RNA體系的riboEDIT? CRISPR-Cas9具體操作方法以及T7E1酶切篩選最有效的crRNA的方法，希望對進(jìn)行基因敲除、瞬時基因表達(dá)、構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)株或動物胚胎干細(xì)胞等CRISPR實(shí)驗的小伙伴們，提供更簡單有效的實(shí)現(xiàn)途徑！如果您遇到了目的基因編輯效率低、很難沉默或敲降、脫靶嚴(yán)重、實(shí)驗繁復(fù)或周期太長，或想一次轉(zhuǎn)染同時編輯細(xì)胞內(nèi)多個靶基因，希望細(xì)胞毒性小，或者不愿冒險接觸病毒類實(shí)驗操作，您就可以果斷地嘗試這一創(chuàng)新的全RNA體系了！
低溫運(yùn)輸：riboEDIT Cas9 mRNA，riboEDIT T7EI Enzyme（液態(tài)儲存）、riboEDIT tracrRNA、riboEDIT crRNA、riboEDIT Positive Control crRNA Validation Set（陽性對照為凍干粉形式，上下游引物為液態(tài)存儲）等組分為干冰運(yùn)輸，riboFECT mRNA Transfection Reagent 為4°C冰袋運(yùn)輸。保存方式：-20 °C 低溫凍存，避免反復(fù)凍融，長期請置于-80℃保存，實(shí)驗過程置于冰上放置，使用完畢后請于-20℃~-80℃小心保存。因不存在DNA插入的風(fēng)險，riboEDIT? CRISPR-Cas9全RNA體系是一種更安全的體系并已獲得專利。riboEDIT?Cas9 mRNA是體外轉(zhuǎn)錄生成的Cas9 mRNA，具有帽子和polyA尾巴結(jié)構(gòu)，編碼序列采用人源密碼子優(yōu)化的S. pyogenes Cas9，帶有核定位信號（NLS），C端的一個1XFLAG標(biāo)簽，5’非翻譯區(qū) (5’UTR)及3’非翻譯區(qū)(3’UTR)，以促進(jìn)mRNA的翻譯和提高mRNA的穩(wěn)定性，與經(jīng)優(yōu)化的縮短長度的crRNA和tracrRNA共同使用，適用于哺乳動物細(xì)胞的基因高效率編輯，相比載體、慢病毒或穩(wěn)轉(zhuǎn)株體系具有諸多優(yōu)勢。實(shí)驗準(zhǔn)備（以轉(zhuǎn)染24孔板為例）(1) 將riboEDIT tracrRNA（5nmol）和riboEDIT crRNA（5nmol）分別加入250μL RNase-free H2O，各自稀釋至20μM，作為儲存溶液。使用前，用RNase-free H2O進(jìn)一步稀釋至10μM，置于冰上備用。注：riboEDIT tracrRNA和riboEDIT crRNA可根據(jù)具體實(shí)驗體系稀釋至合適的濃度使用。(2) riboEDIT Cas9 mRNA（500ng/μL），置于冰上備用。(1) 準(zhǔn)備細(xì)胞：轉(zhuǎn)染前18-24h，取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于24孔板中，實(shí)驗前細(xì)胞密度達(dá)到50%~70%為宜。(2) 取一支1.5mL EP管，加入25μL Opti-MEM減血清培養(yǎng)基，再加入2μL riboFECT mRNA Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑，室溫孵育10min。（不建議加雙抗）(3) 另取一支1.5mL EP管，加入25μL Opti-MEMTM減血清培養(yǎng)基，然后加入2μL riboEDIT Cas9 mRNA（500ng/μL）。(4) 然后加入1μL tracrRNA（10μM）和1μL crRNA（10μM），crRNA和tracrRNA按1:1加入。不同孔板轉(zhuǎn)染體系可按照 表1自行優(yōu)化。(5)將crRNA、tracrRNA、Cas9 mRNA混合物加入到稀釋的轉(zhuǎn)染試劑中，室溫孵育5min。(6)孵育結(jié)束后，將上述制備好的轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)48~72h。(7)提取基因組，使用riboEDIT T7EI Enzyme進(jìn)行基因編輯效率檢測。表1. riboEDIT? Cas9 mRNA轉(zhuǎn)染體系* 轉(zhuǎn)染體系需確保轉(zhuǎn)染總量(pmol)，pmol/μM=加入的體積* 請保證crRNA和tracrRNA按1:1加入在細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，建議使用T7E1酶切法篩選編輯效率高的crRNA進(jìn)行下游實(shí)驗。（1）提取基因組：細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48-72h后，收集細(xì)胞抽提基因組，并用微量紫外分光光度計定量。（2）PCR擴(kuò)增靶基因片段：將純化得到的基因組DNA稀釋至合適的濃度范圍，吸取100ng-500ng基因組DNA用高保真DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，陽性對照組使用riboEDIT? Positive Control crRNA Validation Set的引物進(jìn)行擴(kuò)增，引物信息見表2。注：基因組DNA模板用量及PCR條件需根據(jù)反應(yīng)體系自行優(yōu)化。表2. riboEDIT Positive Control crRNA Validation Set 引物序列（3）DNA片段退火：DNA片段按照表4退火體系進(jìn)行混合，充分混勻后置于PCR中運(yùn)行退火程序（表4）?；?5℃加熱5min，然后自然冷卻至室溫。（4）T7EI酶切：退火完成后，每管加入0.5μL riboEDIT? T7EI Enzyme（10U/μL），37℃溫育30min。（5）電泳檢測： T7E1酶切后，產(chǎn)物進(jìn)行純化，然后使用2%-3%瓊脂糖凝膠電泳或Agilent 2200 Tape Station檢測酶切條帶和編輯效率。MHCC97H細(xì)胞共轉(zhuǎn)染10pmol riboEDIT? crRNA、10pmol riboEDIT? tracrRNA和1ug riboEDIT? Cas9 mRNA，48小時后 riboEDIT? T7EI Enzyme酶切檢測靶位點(diǎn)的剪切效率，候選7個靶基因的剪切條帶及編輯效率。其中，針對7個目的基因分別設(shè)計2條crRNA，其中9條crRNA及其配套體系的編輯效率均達(dá)到50%以上，編輯效率最高的一條達(dá)到81.1%，其中Indel%表示T7E1酶切檢測的編輯效率。
#1和#2表示同一基因不同位點(diǎn)設(shè)計的2條crRNA
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