早在上世紀八九十年代，人們便觀察到細菌毒素刺激或細菌感染的巨噬細胞會發(fā)生裂解性的細胞死亡(1, 2)，起初人們認為這種細胞死亡是細菌主動誘導產(chǎn)生以破壞宿主免疫系統(tǒng)的一種現(xiàn)象，是細菌毒力的體現(xiàn)，并將其誤認為是“細胞凋亡”或者“壞死”。近年來隨著研究的深入，人們逐漸認識到這是一種新型的由細胞自主控制的程序性死亡方式——焦亡（pyroptosis）。

脂多糖（lipopolysaccharide/LPS，又稱內毒素）是革蘭氏陰性細菌外膜的關鍵成分，邵峰院士團隊此前的工作表明人的caspase-4/5和小鼠中的同源蛋白caspase-11可識別胞質中的LPS，發(fā)生自剪切依賴的激活，并進一步切割活化GSDMD，GSDMD蛋白的N端結構域寡聚并插入細胞膜打孔，從而導致細胞焦亡的發(fā)生(3-6)<span “=”” style=”margin: 0px; padding: 0px; border: 0px; font-size: 12pt;”>。越來越多的證據(jù)表明，LPS–caspase-4/11–GSDMD通路所介導的細胞焦亡在宿主抵抗革蘭氏陰性病原菌的免疫防御中發(fā)揮著至關重要的(7)。

非經(jīng)典炎癥小體通路

志賀氏菌屬（Shigella，又稱痢疾桿菌）是引起人類細菌性痢疾（shigellosis）的常見病原菌，它能以極高的效率突破免疫防御并引起出血性腹瀉和嚴重的腸道炎癥。感染發(fā)生時，志賀菌會侵入宿主細胞，迅速逃離介導入侵的膜泡并在胞質內自由地生長繁殖。作為一種革蘭氏陰性菌，這一特殊的生活方式不可避免地使其LPS暴露于caspase-4/11的免疫監(jiān)視之下。然而，caspase-4/11介導的細胞焦亡在抵抗志賀菌感染中所發(fā)揮的功能并不清楚。漫長的共進化過程中，志賀菌又是否獲得了對抗caspase-4/11的法寶呢？

2021年10月20日，北京生命科學研究所邵峰實驗室和北京大學基礎醫(yī)學院劉小云實驗室在 Nature 上合作發(fā)表了題為 Shigella evades pyroptosis by arginine ADP-riboxanation of caspase-11 的研究成果。該研究發(fā)現(xiàn)福氏志賀菌（Shigella flexneri）通過分泌效應蛋白OspC3介導一種全新的翻譯后修飾來抑制caspase-4/11的功能，避免宿主細胞焦亡的發(fā)生，從而逃逸了這一重要的天然免疫防御機制對細菌的識別和清除。

研究伊始，邵峰實驗室的研究人員發(fā)現(xiàn)，在給小鼠感染伯克霍爾德菌（也是一種在胞質中生活的革蘭氏陰性病原菌）時，野生型小鼠可以存活下來，但Casp11敲除的小鼠很快就死亡了，確認了caspase-11對于抵抗革蘭氏陰性菌的重要作用。然而非常意外的是，在志賀菌感染時，兩種小鼠卻沒有表現(xiàn)出明顯差異。

（左：感染志賀菌；右：感染伯克霍爾德菌）

作者通過體外細胞感染模型也發(fā)現(xiàn)，伯克霍爾德菌和沙門氏菌 （均為胞內革蘭氏陰性菌）可以顯著激活caspase-4/11–GSDMD通路介導的焦亡，然而志賀菌感染時卻幾乎觀察不到這一現(xiàn)象。這提示志賀菌可能通過某種方式抑制了caspase-4/11–GSDMD通路的激活。

先前的研究表明，志賀菌可通過其三型分泌系統(tǒng)釋放一些效應蛋白來抑制或影響宿主細胞的多種信號通路。作者對這些效應蛋白進行了分析和篩選，發(fā)現(xiàn)敲除了ospC3的志賀菌（S. f. ΔospC3）可顯著誘導caspase-4/11依賴的GSDMD的切割以及細胞焦亡的發(fā)生，提示志賀菌可能通過分泌OspC3來抑制LPS誘導的細胞焦亡。

那么，OspC3是通過什么機制來發(fā)揮作用的呢？

首先，作者發(fā)現(xiàn)，在宿主細胞中外源表達OspC3即可抑制LPS誘導的GSDMD的切割以及細胞焦亡的發(fā)生，表明志賀菌感染時的確是分泌的OspC3本身抑制了caspase-4/11的功能，并且OspC3行使功能時不依賴于細菌中的其他因子。

進一步地，作者發(fā)現(xiàn)OspC3可以與caspase-4/11發(fā)生相互作用。然而，將重組表達的OspC3與caspase-4/11進行體外孵育時，OspC3并不能抑制caspase-4/11對GSDMD的切割，但將同樣的OspC3蛋白轉入細胞后，LPS誘導的焦亡被抑制了。這表明OspC3不是簡單地通過結合作用來抑制caspase-4/11的功能，而是需要細胞內某種因子的參與才能發(fā)揮作用。

作者注意到，在SDS-PAGE凝膠上，與OspC3共表達的caspase-4遷移速率變慢，非變性膠上也可觀察到條帶位置發(fā)生顯著變化，這一數(shù)據(jù)表明，與OspC3共表達后，caspase-4/11蛋白上很可能發(fā)生了某種翻譯后修飾。

電噴霧電離質譜（ESI-MS）和碰撞誘導解離質譜（CID-MS）分析顯示，與OspC3共表達可使caspase-4/11的分子量增加524道爾頓（Da）。然而令人疑惑的是，524 Da的質量與任何已知的翻譯后修飾都不匹配。

這一出乎意料的現(xiàn)象愈發(fā)激起了作者們的研究興趣。作者對發(fā)生修飾的肽段進行二級串聯(lián)質譜分析，發(fā)現(xiàn)了質量與腺苷、單磷酸腺苷（AMP）和二磷酸腺苷（ADP）相匹配的離子。這讓作者聯(lián)想到了一種廣泛存在的翻譯后修飾：ADP-核糖基化（ADP-ribosylation）。在這種修飾中，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）作為供體，其中的ADP-核糖（ADPR）基團被轉移到氨基酸殘基的側鏈上，使其分子量增加541 Da。

ADP-核糖基化示意圖（但今天的故事遠沒有這么簡單）

作者發(fā)現(xiàn)，在NAD⁺存在的情況下，純化的OspC3蛋白可在體外重組反應中重現(xiàn)共表達條件下對caspase-4/11的修飾，這證明OspC3就是直接催化該翻譯后修飾的酶，并且這種修飾的供體也是NAD⁺。然而，OspC3介導的修飾比ADP-核糖基化小了17 Da （524 Da vs. 541 Da），證明這一修飾與ADP-核糖基化并不相同。

進一步地，作者通過電子轉移/高能碰撞解離質譜（EThcD-MS）分析發(fā)現(xiàn)，524 Da 的修飾分別發(fā)生在caspase-4 第314位或caspase-11第310位的精氨酸殘基上 （R314/R310），將R314/R310突變?yōu)橘嚢彼峄蛱於０泛螅揎棽辉侔l(fā)生。

至此，一個嶄新的科學問題擺在作者面前：利用NAD⁺作為供體，如何給精氨酸殘基加上524 Da的修飾？

通過分析多種NAD⁺ 類似物進行體外修飾反應的結果，作者證明，NAD⁺中的ADP-核糖基團被轉移到了底物蛋白上，同時釋放了煙酰胺，定量的高效液相色譜-質譜聯(lián)用（HPLC-MS）分析也證明修飾反應的確釋放了煙酰胺。這與已知的ADP-核糖基化的過程一致。那么，減小的17 Da源自何處呢？從分子量上分析，減小17 Da很可能是由于發(fā)生了脫氨反應，而可能的脫氨位點只有兩個：腺苷上的氨基和精氨酸側鏈的氨基。

首先，作者檢測了修飾反應后的產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)的確產(chǎn)生了氨。作者又利用一種焦磷酸鍵水解酶NUDT16與修飾后的caspase-4反應，發(fā)現(xiàn)成功地從修飾中去除了一個完整的AMP基團，證明在該修飾中AMP部分是保持不變的，這也表明脫去的氨基應該就是精氨酸側鏈的氨基。的確，利用已經(jīng)脫氨的NAD⁺（Deamino-NAD⁺）進行修飾反應時，從分子量變化分析也存在脫氨反應。至此，一切證據(jù)都指向精氨酸側鏈在修飾中發(fā)生了脫氨。如何才能直接證明這一點呢？作者創(chuàng)造性地利用穩(wěn)定同位素氨基酸標記 （SILAC）結合質譜分析的方法，發(fā)現(xiàn)修飾后的精氨酸殘基失去了一個氮原子（N），為精氨酸殘基上發(fā)生的脫氨反應找到了直接證據(jù)。至此，作者證明了OspC3介導的修飾反應實質上由精氨酸殘基的ADP-核糖基化和脫氨組合而成（+541-17 = 524 Da）。

那么這個脫氨反應是如何發(fā)生的呢？從化學角度分析，脫氨需要一個靠近精氨酸側鏈的親核基團發(fā)動進攻，使氨基離去。作者推測核糖基團的2’-OH可能扮演了這一角色，于是他們合成了2’-OH被氫原子替代的 NAD⁺類似物 （2’-Deoxy-2’-H-NAD⁺），并用其進行了體外修飾反應。實驗結果表明，2’-OH親核基團的喪失，使修飾反應停留在ADP-脫氧核糖基化，不再能發(fā)生脫氨。所以，在OspC3介導的修飾中，核糖基團的2’-OH發(fā)動親核進攻取代了精氨酸側鏈的氨基。

然而，此時的信息依然不足以明確這種修飾的化學結構，因為理論上精氨酸側鏈的三個N都可以接收ADP-核糖基團，而ADP-核糖基化發(fā)生的位置決定了這個修飾最終的化學結構。為了得到準確的答案，作者利用一種小分子茚三酮 （ninhydrin）可以與精氨酸側鏈末端氮原子發(fā)生反應的特性，證明了δ位的氮原子（N^δ）接收了ADP-核糖基團。

通過一系列設計精妙的生化實驗和嚴密的邏輯推理，作者最終發(fā)現(xiàn)OspC3通過催化兩步親核取代反應，實現(xiàn)利用NAD⁺對caspase-4/11-R314/R310的共價修飾（建議感興趣的讀者閱讀原文）。首先，精氨酸上的N^δ對NAD⁺中的煙酰胺進行親核取代，這與目前已知的精氨酸ADP-核糖基化（發(fā)生在N^ω上）是不同的。隨后，ADP-核糖基團的ribosyl-2’-OH被活化，進攻精氨酸側鏈末端胍基的碳原子，引發(fā)脫氨反應，從而在脫去一個氨基的精氨酸和ADP-核糖基團之間形成一個惡唑烷環(huán) （oxazolidine）的共價連接結構。作者將這種全新的修飾命名為ADP-riboxanation，并據(jù)此將OspC3的活性定義為精氨酸ADP-riboxanase。

那么，為何發(fā)生了ADP-riboxanation的caspase-4/11不再能介導細胞焦亡呢？

作者發(fā)現(xiàn)，OspC3首先阻斷了LPS誘導的caspase-4/11的自切割，從而抑制了caspase-4/11的活化。此外， OspC3也可以對已經(jīng)活化的caspase-4/11進行修飾，從而干擾caspase-4與GSDMD的結合位點，使其不再能與GSDMD形成穩(wěn)定的蛋白復合體。修飾后的caspase-4/11失去了結合和切割GSDMD的能力，同時也失去了切割其最適多肽底物的能力。通過對caspase家族的蛋白序列進行比對分析，作者發(fā)現(xiàn)修飾發(fā)生的R在所有caspase家族成員中都是保守的，將caspase-4/11 的 R314/310突變?yōu)橘嚢彼?、丙氨酸或谷氨酸均可使其失活?strong>因此，R314/310 ADP-riboxanation破壞了caspase-4/11蛋白酶關鍵位點的生化特性，使它們喪失了基本的切割多肽的功能。

研究清楚對底物caspase-4/11的修飾機制后，作者又將目光轉回到酶本身——作為精氨酸ADP-riboxanase，OspC3是如何識別底物蛋白并發(fā)揮功能的呢？

福氏志賀菌共編碼三個OspC家族蛋白：OspC1、OspC2和OspC3。盡管這三個蛋白的序列一致性超過60%，但與OspC3不同的是，OspC1/2幾乎不修飾caspase-4，也不能抑制LPS誘導的細胞焦亡?；谛蛄蟹治龅慕Y構預測表明它們均包含一個位于C端的ankyrin repeats domain（ARD，介導蛋白質間的相互作用）和一個未知功能的N端結構域。

作者進一步發(fā)現(xiàn)，OspC3的ARD，而不是OspC1/2的ARD，能夠與caspase-4發(fā)生相互作用。將OspC3的ARD替換為OspC1/2的ARD，幾乎完全去除了其對caspase-4的修飾功能。相反，將Ospc1/2的ARD 替換為OspC3的ARD后，它們也可以高效地修飾caspase-4并抑制LPS誘導的細胞焦亡。因此，OspC3的ARD結構域決定了其對底物caspase-4/11的識別，并且提示OspC家族蛋白都具備保守的ADP-riboxanase活性，并以ARD結構域的多樣性實現(xiàn)對不同底物蛋白的選擇。

作者通過大量的突變篩選發(fā)現(xiàn)了多個OspC3發(fā)揮修飾功能的關鍵殘基，均位于其N端的酶活結構域內且在OspC家族中高度保守。值得一提的是，D177A的突變導致OspC3介導的修飾停留在ADP-核糖基化，阻止了隨后的脫氨反應，這對上文中經(jīng)推理分析得出的兩步親核取代的反應機制提供了強有力的佐證。D177A-OspC3介導的修飾可被細胞中的精氨酸ADP-核糖基水解酶去除，但ADP-riboxanation抵抗了所有已知的ADP-核糖基水解酶的去修飾作用。因此，通過ADP-riboxanation來抑制caspase-4/11對細菌來說更為有利。

（上：ADP-riboxanation；下：ADP-ribosylation）

最后，作者回到動物模型上，對OspC3在志賀菌感染過程中的生物學意義進行了更加深入的解析。

作者發(fā)現(xiàn)，在野生型志賀菌致死劑量的感染條件下，野生型小鼠在感染OspC3活性缺失的菌株后可以存活。然而，Casp11敲除小鼠對野生型和ospC3敲除的菌株同樣敏感。對小鼠器官的細菌負荷量進行檢測也得到了類似的結論。這些結果表明Ospc3介導的caspase-11的失活在志賀菌逃逸宿主免疫防御中具有關鍵作用。

值得注意的是，與感染野生型志賀菌的小鼠相比，感染ospC3敲除菌株的小鼠產(chǎn)生了更多抗志賀菌的抗體，且在面臨再次感染時表現(xiàn)出更強的抵抗力，而這一現(xiàn)象在Casp11或Gsdmd敲除的小鼠中并不存在。這一發(fā)現(xiàn)揭示了caspase-11介導的細胞焦亡對激活適應性免疫也起一定作用。據(jù)此，作者發(fā)現(xiàn)ospC3的敲除可以作為一種潛在的志賀菌減毒活疫苗的開發(fā)策略。

最后，作者還發(fā)現(xiàn)OspC家族蛋白在多種細菌中存在，這提示ADP-riboxanation修飾可能被廣泛應用于多種生物學場景。

綜上所述，該研究發(fā)現(xiàn)了一種由OspC家族蛋白介導的新型翻譯后修飾——精氨酸ADP-riboxanation。志賀菌分泌效應蛋白OspC3對caspase-4/11的R314/310進行修飾，阻斷了caspase-4/11的活化及其對GSDMD的切割，抑制了LPS誘導的細胞焦亡，從而逃逸了caspase-4/11–GSDMD所介導的宿主抗胞內革蘭氏陰性菌的免疫機制。該研究不僅揭示了志賀菌——這一重要的腸道病原菌如何逃逸宿主的天然免疫系統(tǒng)，也開辟了蛋白質翻譯后修飾領域一個全新的研究方向，堪稱邵峰團隊在宿主和病原菌相互作用領域又一里程碑式的工作。

邵峰實驗室李子霖博士為本文第一作者。邵峰實驗室劉旺博士，劉小云實驗室付嘉琦博士以及中科院生物物理所丁璟珒博士亦為本工作做出重要貢獻。論文的其他作者還包括程森博士，許悅博士，王志強，劉筱璠，史旭焱，劉亞鑫和齊湘兵博士。邵峰博士和劉小云博士為本文共同通訊作者。該研究由科技部國家重點研發(fā)計劃，中科院戰(zhàn)略先導科技專項，國家自然科學基金，以及中國醫(yī)學科學院醫(yī)學與健康科技創(chuàng)新工程資助，在北京生命科學研究所完成。

參考文獻

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來源：NIBS