神經(jīng)細胞的靜息膜電位（Resting Membrane Potential, RMP）影響著神經(jīng)細胞的可興奮性，對于維持神經(jīng)細胞正常的生理功能至關重要。鈉漏通道NALCN（Sodium Leak Channel, Nonselective）介導了神經(jīng)細胞的鈉漏電流，能使靜息膜電位更加去極化，從而提高神經(jīng)細胞的可興奮性^1-4。NALCN在哺乳動物中高度保守，與電壓門控鈣離子通道（CaV）和電壓門控鈉離子通道（NaV）同源性較高。NALCN參與了諸多與神經(jīng)系統(tǒng)相關的重要的生物學過程，包括呼吸節(jié)律的調節(jié)¹、痛覺感知⁵、生物鐘的調節(jié)⁶和快速動眼睡眠⁷等。在人群中，NALCN的單點突變就會引起多種嚴重的神經(jīng)發(fā)育遺傳疾病，包括精神運動發(fā)育遲緩和具有特征面相的小兒肌張力低下癥（IHPRF）^8,9，以及四肢和面部先天性攣縮、肌張力低下和發(fā)育遲緩癥（CLIFAHDD）¹⁰等。盡管NALCN通道有著如此重要的功能，但其工作機制仍不清楚。有報道顯示在HEK293細胞和爪蟾卵母細胞等異源體系中，只有共同表達NALCN，F(xiàn)AM155，UNC79和UNC80四個亞基，才能測量到明顯并且典型的鈉漏電流⁴。其中，NALCN是孔道形成亞基；FAM155是跨膜胞外調控亞基¹¹，協(xié)助NALCN上膜；而UNC79和UNC80是分子量巨大（300 kDa和370 kDa），且不與任何已知蛋白具有序列同源性的胞質調控亞基³。

2022年5月12日，北京大學未來技術學院分子醫(yī)學研究所、北大-清華生命科學聯(lián)合中心、國家生物醫(yī)學成像中心陳雷研究組在Nature Communications 雜志上報道NALCN-FAM155A-UNC79-UNC80復合物的冷凍電鏡結構及UNC79-UNC80調節(jié)NALCN-FAM155A的機制。

陳雷研究組在2020年曾報道過NALCN-FAM155A亞復合體的高分辨率結構¹²，闡明了NALCN的鈉離子選擇性、胞外鈣離子阻塞和電壓調節(jié)特性的結構基礎，發(fā)現(xiàn)了在NALCN通道中獨有的位于II-III linker上的CIH螺旋結合在CTD上。但是UNC79和UNC80的結構以及它們是如何激活NALCN的并不清楚。本項研究主要使用結構生物學及電生理的手段，來探究UNC79和UNC80是如何激活NALCN的。先前的研究表明，UNC79和UNC80容易與NALCN-FAM155A亞復合體發(fā)生解離，因此，作者在NALCN的C末端融合了GFP，UNC80的N末端融合了與GFP高親和力結合的納米抗體以穩(wěn)定UNC79/80與NALCN間的相互作用。經(jīng)過同源蛋白篩選等步驟，作者們確定以大鼠NALCN和小鼠FAM155A, UNC79和UNC80亞基組成的復合體為研究對象，并在克服了樣品制備、數(shù)據(jù)處理等困難后，通過單顆粒冷凍電鏡技術獲得了整體分辨率為3.2 ?的四元復合物的電子密度，并搭建了準確的原子模型。結構顯示UNC79和UNC80均由富含螺旋的結構組成，這些螺旋進一步的組裝成HEAT重復或ARM重復等超螺旋結構。UNC79的N端與UNC80的C端、UNC79與UNC80的中間鉸鏈區(qū)以及UNC79的C端與UNC80的N端均存在著緊密的相互作用，形成鉗子狀的復合體，整體形狀類似于無窮號“∞”（圖1）。除了HEAT重復和ARM重復外，UNC80含有一個類泛素結構域，并且UNC79和UNC80的還各含有一個鋅指結構域。NALCN-FAM155A亞復合體位于UNC79和UNC80的中間鉸鏈區(qū)的上方，并且NALCN的跨膜區(qū)以及胞質C端結構域（CTD）并不直接與UNC79和UNC80發(fā)生相互作用。NALCN主要是通過胞內loop區(qū)與UNC79-UNC80發(fā)生相互作用的：NALCN胞質側的I-II linker中的一段β-發(fā)卡結構（UNIM-A）與UNC79發(fā)生相互作用，II-III linker中的一段loop-螺旋結構（UNIM-B）以及一段L型螺旋結構（UNIM-C）與UNC80發(fā)生相互作用（圖1）。作者將NALCN與UNC79/80發(fā)生相互作用的基序命名為UNC Interacting Motif (UNIM)。

圖1：NALCN-FAM155A-UNC79-UNC80復合體的結構

隨后作者基于該結構研究了UNC79和UNC80是如何調控NALCN活性的，發(fā)現(xiàn)UNC79, UNC80和FAM155A三個附屬亞基對于NALCN能夠正確的轉運到細胞膜上是必不可少的。當突變UNIM-A或UNIM-B以破壞UNIM-A或UNIM-B與UNC79/80的相互作用后，能夠正確轉運到細胞膜上的NALCN變得很少，鈉漏電流也變得很小，表明UNIM-A和UNIM-B與UNC79/80之間的互作對于NALCN能夠正確轉運到細胞膜上是必不可少的。這有可能是因為這些互作使UNC79/80遮擋了NALCN胞質側loop上的內質網(wǎng)滯留信號，從而促進NALCN上膜（圖2）。

圖2：UNC79-UNC80激活NALCN的機制的示意圖

與UNIM-A和UNIM-B不同的是，當突變UNIM-C以破壞UNIM-C與UNC79/80的相互作用后，NALCN的上膜和鈉漏電流的大小均不受影響，但NALCN更難以被電壓激活，電導-電壓曲線（G-V curve）發(fā)生明顯右移。作者們發(fā)現(xiàn)UNIM-C與UNC80的互作會牽引II-III linker中原本結合在NALCN的CTD上的一段螺旋（CTD Interacting Helix, CIH）與CTD發(fā)生解離，從而解除CIH的自抑制作用，激活NALCN（圖2）。

該項研究在2021年12月21日即公布在預印本BioRxiv上（https://doi.org/10.1101/2021.12.20.473568）。在2021年12月美國基因泰克公司的Jian Payandeh研究組和2022年4月西湖大學的閆湞研究組分別在Nature¹³和Cell Discovery¹⁴雜志上也報道了人源的NALCN-FAM155A-UNC79-UNC80復合體的冷凍電鏡結構。與這些研究相比，本研究觀察到的結構整體相似，并且通過功能實驗闡明了UNC79-UNC80是如何通過促進NALCN上膜以及解除CIH自抑制作用來激活NALCN的，為深入理解NALCN復合體的工作機制奠定了基礎。

本項研究第一作者為陳雷課題組博士后康云路，陳雷為第二作者兼通訊作者。本工作獲得科技部重點研發(fā)計劃、國家自然科學基金委、北大-清華生命科學聯(lián)合中心等經(jīng)費支持?？翟坡帆@得了北京大學博雅博士后獎學金的支持。該工作的冷凍電鏡樣品制備、篩選和采集在北京大學冷凍電鏡平臺上完成，得到了李雪梅、郭振璽、秦昌東、裴霞和王國鵬等人的幫助。該項目的數(shù)據(jù)處理獲得了北京大學CLS計算平臺及未名超算平臺的硬件和技術支持。賓夕法尼亞大學Dejian Ren教授提供了大鼠和人源NALCN，小鼠UNC79和UNC80的cDNA。

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來源：北京大學