口腔鱗狀細胞癌（OSCC）是頭頸部鱗狀細胞癌的主要類型，惡性程度高，5年生存率為50%，是一種多階段漸進惡變的惡性腫瘤，可從正常黏膜-癌前病變-癌演變而來，其中口腔白斑（OLK）是最常見的口腔癌前病變，口腔白斑惡變率可達11.7-23.1% [1,2]。因此，若能在癌前病變階段施加干預措施，則可有效預防口腔黏膜癌變，提高患者生存率。近年來，以抗PD-1抗體為核心的免疫治療在全身多種腫瘤治療中取得重要進展，但在口腔鱗癌中應答率不到20%，提示存在其它免疫逃逸途徑[3]。因此，需要對口腔癌變進程中細胞類型和分布的動態(tài)變化進行全面的表征，尋找該進程中介導免疫逃逸的關鍵分子，為口腔鱗癌的治療提供新的靶點。

2022年8月16日，中山大學附屬口腔醫(yī)院的王智教授團隊以及北京大學生物醫(yī)學前沿創(chuàng)新中心（BIOPIC）、北京未來基因診斷高精尖創(chuàng)新中心（ICG）、生命科學學院的白凡教授團隊聯(lián)合在The Journal of Clinical Investigation雜志發(fā)表題為TDO2⁺ myofibroblasts mediate immune suppression in malignant transformation of squamous cell carcinoma的研究論文。該研究采用單細胞多組學技術和體內(nèi)體外實驗，發(fā)現(xiàn)TDO2⁺肌成纖維細胞是介導T細胞免疫抑制的關鍵細胞亞群。

該研究對13例口腔鱗癌組織、3例白斑組織和8例癌旁正常組織進行單細胞測序，并對T細胞進行了V（D）J測序，共獲得131702個高質(zhì)量細胞，最終定義了10個細胞亞群（圖1）。

圖1: 單細胞測序流程和主要細胞類型

研究發(fā)現(xiàn)，隨著口腔癌變的進展，CD4⁺ T細胞中靜止及活化的調(diào)節(jié)性T細胞（Tregs）、耗竭CD4⁺ T細胞占比逐漸升高；具有高增殖能力的過渡態(tài)CD4⁺T細胞主要分化為活化的Tregs以及耗竭CD4⁺ T細胞（圖2A-D）。此外，研究者發(fā)現(xiàn)CD8⁺ T細胞存在終末耗竭、過渡耗竭和前體耗竭CD8⁺ T細胞亞群，并且在癌旁-癌前病變-癌組織中均呈逐漸升高的趨勢，前體耗竭及過渡耗竭CD8⁺ T細胞均朝向終末耗竭方向分化（圖2E-H）。以上結果顯示在口腔癌變過程中CD4⁺及CD8⁺ T細胞均存在表型轉換，其中CD4⁺ T細胞主要轉換為具有免疫抑制功能的Tregs，而CD8⁺T細胞則轉換為耗竭表型。

圖2: 口腔癌變進程中CD4⁺/CD8⁺ T細胞的亞群分布和分化軌跡

為探究腫瘤微環(huán)境中基質(zhì)細胞是否可介導T細胞免疫抑制，研究者對基質(zhì)細胞進行聚類分群，發(fā)現(xiàn)基質(zhì)細胞中存在2群肌成纖維細胞亞群，兩個亞群均呈現(xiàn)在癌旁正常組織中缺失，在癌前病變和癌組織中逐漸增加的特征（圖3A-B）。進一步分析發(fā)現(xiàn)，其中一個亞群（MF-C1-TDO2，高表達TDO2和CXCL9）同時具有T細胞趨化和色氨酸代謝功能，而另一個亞群（MF-C2-ELN，高表達ELN）則具有基質(zhì)重塑功能（圖3C-G）。通過免疫熒光證實TDO2僅表達于癌組織的a-SMA⁺肌成纖維細胞中（圖3F），并且通過多色免疫組化（mIHC）染色證明其主要位于癌巢組織外圍（圖4A-D）。組織內(nèi)mIHC染色及體外高內(nèi)涵成像結果顯示該群TDO2⁺肌成纖維細胞具有較強的T細胞趨化功能（圖4E-H）。

圖3: 口腔癌變進程中肌成纖維細胞的亞群分布、功能差異和分化軌跡

圖4: TDO2⁺肌成纖維細胞在口腔癌中的空間分布和體外高內(nèi)涵成像結果

上述結果顯示TDO2⁺肌成纖維細胞位于癌巢外圍，并具有強烈的T細胞趨化功能，那么該群細胞是否介導T細胞免疫抑制呢？通過mIHC染色，研究者發(fā)現(xiàn)TDO2⁺肌成纖維細胞周圍富集更多的Tregs (Foxp3⁺CD4⁺)和耗竭 CD8⁺T 細胞（TIM-3⁺PD-1⁺ CD8⁺）。為進一步探究TDO2⁺肌成纖維細胞對T細胞的影響，研究者利用siRNA對口腔癌組織中分離的肌成纖維細胞進行TDO2基因敲低后，與CD4⁺/CD8⁺T細胞共培養(yǎng)，結果顯示共培養(yǎng)體系中的Tregs和耗竭CD8⁺T細胞占比均降低，同時CD8⁺T細胞的殺傷功能增強。采用TDO2抑制劑LM10處理肌成纖維細胞可觀察到相似結果。此外，免疫組化染色結果顯示腫瘤間質(zhì)中高豐度TDO2⁺肌成纖維細胞可提示口腔鱗癌患者預后較差（圖5）。

圖5: TDO2⁺肌成纖維細胞對CD4⁺/CD8⁺T細胞的抑制作用

研究結果證明，雖然TDO2⁺肌成纖維細胞具有較強的T細胞趨化功能，但是趨化而來的CD4⁺/CD8⁺T細胞出現(xiàn)明顯的免疫抑制狀態(tài)，提示該群肌成纖維細胞可能在癌巢外圍構筑“陷阱”，通過TDO2催化的色氨酸代謝途徑，誘導T細胞免疫抑制，促進腫瘤免疫逃逸。該結果可部分解釋為何口腔黏膜惡變進程中雖然病損內(nèi)有大量T細胞浸潤，但仍出現(xiàn)PD-1治療抵抗的原因。

最后，研究者采用4NQO誘導小鼠口腔內(nèi)自發(fā)成瘤，并采用TDO2抑制劑LM10進行體內(nèi)治療，結果顯示TDO2抑制劑可有效阻止小鼠口腔黏膜白斑惡變（圖6）。此外，采用小鼠口腔癌細胞進行小鼠皮下成瘤，證實TDO2抑制劑聯(lián)合抗PD-1抗體在阻止口腔鱗癌進展中有更好的效果（圖7A-B），而在裸鼠身上TDO2抑制劑沒有發(fā)揮作用（圖7C-D），提示TDO2抑制劑介導的抗腫瘤反應呈T細胞依賴性。

圖7: TDO2抑制劑聯(lián)合抗PD-1抗體在阻止口腔鱗癌進展中有更好的效果

該研究系統(tǒng)描繪了口腔黏膜癌變進程中T細胞、髓系細胞和中性粒細胞等免疫細胞以及基質(zhì)細胞的動態(tài)變化圖譜，并發(fā)現(xiàn)在口腔癌巢外周TDO2⁺肌成纖維細胞具有較強的T細胞趨化和抑制功能，通過實驗證明抑制該群肌成纖維細胞可有效促進抗腫瘤免疫反應。本研究為口腔鱗癌的免疫逃逸提出了新的機制，為阻斷口腔癌的發(fā)生發(fā)展提供了新的靶點。

圖8: TDO2⁺肌成纖維細胞是介導口腔癌中T細胞免疫抑制的關鍵亞群

中山大學附屬口腔醫(yī)院的王智教授以及北京大學生物醫(yī)學前沿創(chuàng)新中心（BIOPIC）、北京未來基因診斷高精尖創(chuàng)新中心（ICG）、生命科學學院白凡教授是本文的共同通訊作者。北京大學BIOPIC、前沿交叉學科研究院的博士研究生胡思夢、中山大學附屬口腔醫(yī)院的盧渙滋博士、謝文強博士和王迪侃博士是本文的共同第一作者。該課題得到了科技部重大專項、廣東省重點領域研發(fā)計劃的資助。

論文鏈接
https://www.jci.org/articles/view/157649

參考文獻
1. Chi AC, et al. Oral cavity and oropharyngeal squamous cell carcinoma–an update. CA Cancer J Clin.65(5), 401-421(2015).
2. Yardimci G, et al. Precancerous lesions of oral mucosa. World J Clin Cases. 2(12), 866-872(2014).
3. Schoenfeld JD, et al. Neoadjuvant nivolumab or nivolumab plus ipilimumab in untreated oral cavity squamous cell carcinoma: a phase 2 open-label randomized clinical trial.JAMA Oncol. 6(10), 1563-1570(2020).

白凡，北京大學生物醫(yī)學前沿創(chuàng)新中心(BIOPIC)、北京未來基因診斷高精尖創(chuàng)新中心(ICG)、生命科學學院研究員，北京大學第一醫(yī)院兼職研究員，博士生導師，國家自然科學基金委優(yōu)秀青年科學基金、杰出青年科學基金獲得者。2003年本科畢業(yè)于北京大學物理系，2008年獲得英國牛津大學生物物理博士學位，2008-2011年間先后在牛津大學、日本大阪大學從事博士后研究工作。

白凡實驗室將綜合利用單分子熒光顯微成像技術、單細胞基因測序技術，研究與醫(yī)學臨床直接相關的前沿課題，包括：（1）單細胞基因測序技術應用于癌癥病人外周血循環(huán)腫瘤細胞研究，探索癌癥轉移的分子生物學機制及無創(chuàng)癌癥診斷、預后判斷、療效評價的臨床方法；（2）大樣本基因測序研究中國人群高發(fā)癌癥的基因突變特征，發(fā)掘引起癌癥表型轉化、轉移的關鍵驅動事件；（3）研究細菌行為、致病性，抗生素殺菌原理和細菌抗藥、耐藥的分子機制。