前面我們講述了miRNA的生成過程，以及常用預(yù)測靶基因數(shù)據(jù)庫。對于miRNA的研究，相對來說比較簡單，可以稱得上“投資小，回報快”。通過表達(dá)譜分析尋找疾病相關(guān)miRNA 并進(jìn)行發(fā)病機(jī)理研究，最終應(yīng)用于腫瘤診斷和治療，已經(jīng)成為目前 miRNA 研究的重要方向。

下面我們就簡單講一下miRNA的研究方法，可以分為以下幾個方面：

①miRNA芯片:利用miRNA 芯片，可以高通量分析不同腫瘤樣本或者不同組織中miRNA的差異表達(dá)，對靶基因進(jìn)行分析，及發(fā)育變化中的作用。

②過表達(dá)和封閉:通?；蚬δ苎芯砍３２捎眠^表達(dá)、干擾、敲除等方法。研究miRNA的功能也不例外。通過導(dǎo)入化學(xué)合成的小分子miRNA mimics（mirRNA的成熟體），或者構(gòu)建mirRNA過表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)過表達(dá)特定mirRNA的目的。通過構(gòu)建抑制miRNA的inhibitor，實(shí)現(xiàn)抑制特定mirRNA功能的目的。觀察靶基因mRNA及編碼蛋白表達(dá)以及細(xì)胞、動物水平的表型變化，進(jìn)行信號通路研究，是目前miRNA 功能研究的常用方法。

③雙螢光素酶報告系統(tǒng):通過生物信息學(xué)分析獲得miRNA的靶基因及相應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)是功能研究的關(guān)鍵內(nèi)容。將野生型和結(jié)合位點(diǎn)突變的3ˊ-UTR 序列克隆入商品化的雙螢光素酶報告載體中，通過檢測熒光素酶報告系統(tǒng)發(fā)光的強(qiáng)弱，對miRNA以及靶基因結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行體外功能驗(yàn)證。

④QPCR 驗(yàn)證：可以用來檢測miRNA 以及其靶mRNA 和相關(guān)mRNA 等的檢測，主要方法有莖環(huán)法和加尾法等。前者針對特定miRNA 設(shè)計引物，特異性好，然而成本較高，周期長；后者采用通用引物，時間短，通量較大。

對于miRNA芯片或者miRNA mimics/inhibitor等，一般可以選擇從公司購買。對于QPCR 驗(yàn)證，涉及到的主要是miRNA的引物設(shè)計，而miRNA的引物設(shè)計方法與常規(guī)引物設(shè)計方法不同。下面就詳細(xì)講解一下miRNA的熒光定量PCR引物設(shè)計方法-莖環(huán)法。

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miRbase：microRNA是基因注釋數(shù)據(jù)庫。通過miRbase，我們可以得到microRNA的成熟序列。

1. 打開主頁，輸入查詢名稱以mir-191-5p為例

2. 在顯示結(jié)果中，選擇第一個mmu-miR-191-5p.

3. 點(diǎn)擊進(jìn)入之后，可以看到mmu-miR-191-5p的成熟序列信息

4.點(diǎn)擊sequence,得到mmu-miR-191-5p序列，長度為23個堿基。

>mmu-miR-191-5p MIMAT0000221

CAACGGAAUCCCAAAAGCAGCUG

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在設(shè)計microRNA引物時需要借助一款小軟件，miRNA RT primer.

1.一般可以采用的的莖環(huán)序列是：

5′ GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGAC3′

2.pcr通用下游引物是: 5′ CAGTGCGTGTCGTGGAGT 3′

3.在軟件中輸入mmu-miR-191-5p的成熟序列，點(diǎn)擊確定

4.如圖所示，首先可以得到miRNA的逆轉(zhuǎn)錄引物 5′—GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCAGCTGC—3′

以及miRNA的模板序列

5′—CAACGGAATCCCAAAAGCAGCTGGTCGTATCCAGTGCAATTGCCGACTCCACGACACGCACTGGATACGAC—3’。

5.下一步設(shè)計PCR上游引物。,選擇primer3plus 在線引物設(shè)計網(wǎng)站，將模板序列的第一條序列、mmu-miR-191-5p淺紅色序列及2個深紅色堿基序列、通用下游引物復(fù)制粘貼至進(jìn)去，如下圖所示

6. 點(diǎn)擊General setting,設(shè)置引物擴(kuò)增長度,引物長度，點(diǎn)擊pick primers

7. 引物設(shè)計結(jié)果如下所示

總結(jié)一下，設(shè)計得到mmu-miR-191-5p的：

pcr上有引物是5’CAACGGAATCCCAAAAGC3′

pcr通用下游引物是: 5′ CAGTGCGTGTCGTGGAGT 3′

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來源：醫(yī)學(xué)方