胃癌是一種高發(fā)病率、高死亡率的惡性腫瘤，具有強烈的腫瘤異質性，在臨床上常表現(xiàn)為多樣的組織病理學類型。例如，按照最新的WHO消化系統(tǒng)腫瘤分類，胃癌包括管狀腺癌、乳頭狀腺癌、低粘附癌、印戒細胞癌、神經(jīng)內(nèi)分泌癌以及肝樣胃癌等多種病理類型。其中混合型胃癌是高度腫瘤內(nèi)部異質性的典型代表，同一個腫瘤中至少含有兩種以上病理成分，且更容易復發(fā)和轉移。然而，目前基于組織病理學的胃癌分型在指導臨床治療中發(fā)揮的作用仍然有限，關鍵原因是目前對胃癌不同病理亞型的分子特征認知不足，這是亟待進一步探究的方向。

4月12日，北京大學生物醫(yī)學前沿創(chuàng)新中心（BIOPIC）、北大-清華生命科學聯(lián)合中心湯富酬教授課題組與合作者在National Science Review期刊發(fā)表了題為“Integrative single-cell multiomics analyses dissect molecular signatures of intratumoral heterogeneities and differentiation states of human gastric cancer”的研究論文。

論文截圖

在該研究中，研究人員利用胃癌根治性手術切除標本，收集配對的癌旁、原發(fā)灶、淋巴結轉移灶并對每個腫瘤部位進行多點采樣，對來自14例胃癌患者的85個樣品進行了優(yōu)化的單細胞多組學【基因組（拷貝數(shù)變異）、DNA甲基化組、染色質狀態(tài)組、以及轉錄組】測序（scTrio-seq3），并結合同一采樣位點的組織病理學分型結果進行了系統(tǒng)、深入的數(shù)據(jù)整合分析，精準繪制了胃癌的單細胞DNA甲基化圖譜，揭示了混合型胃癌不同分化狀態(tài)癌細胞的多個組學層面的關鍵分子特征以及免疫微環(huán)境特征，有望為胃癌的臨床診斷和治療提供新的理論依據(jù)。

實驗設計

該研究的主要發(fā)現(xiàn)如下：

1、揭示了不同胃癌患者癌細胞基因表達異常的共性規(guī)律

該研究篩選出334個在14例胃癌患者的癌細胞中普遍上調的基因以及82個普遍下調的基因。通過與癌旁正常胃上皮細胞以及結直腸癌癌旁正常腸上皮細胞的系統(tǒng)比較，發(fā)現(xiàn)胃癌異常上調基因中有26個是腸上皮細胞特異高表達的基因，例如TFF3、CLDN3、CLDN4、CLDN7、TMEM176A、TMEM176B和MUC13等。這不僅發(fā)生在腸型胃癌中，也發(fā)生在彌漫型以及混合型胃癌中。同時，一些正常胃上皮細胞特異性表達并參與行使胃正常生理功能的基因在胃癌細胞中普遍顯著下調，例如PGA3、PGA5、PGC、LIPF、GKN1、GKN2、MUC1、MUC5AC和MUC6等。這說明胃癌的腫瘤發(fā)生過程中上皮細胞發(fā)生去分化，失去部分正常胃上皮的基因表達特征和正常生理功能。同時，由于這些癌細胞的可塑性增加，因而異常表達了數(shù)十個腸上皮高表達基因。因為在正常發(fā)育過程中，胃上皮和腸上皮來自共同的消化道上皮前體細胞，胃癌細胞異常表達部分腸上皮特異性基因說明胃癌細胞失去部分分化特征的同時獲得了很強的可塑性，這對理解胃癌易復發(fā)、易耐藥的特征提供了新的研究視角。

26個正常結腸上皮高表達并在胃癌細胞中上調的基因。NAT，胃癌癌旁正常上皮細胞

通過聯(lián)合單細胞表觀組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，基因啟動子區(qū)域染色質可及性和DNA甲基化水平的異常改變可能解釋部分基因在胃癌細胞中表達量的異常改變，為理解胃癌發(fā)生過程中基因表達異常的表觀遺傳學調控提供了重要線索。

代表性基因的表達水平與啟動子DNA甲基化和啟動子染色質可及性

2、系統(tǒng)繪制了胃癌的單細胞DNA甲基化圖譜

多個胃癌患者共有的胃癌細胞中異常甲基化的基因（啟動子區(qū)域）

該研究系統(tǒng)繪制了胃癌單細胞DNA甲基化圖譜，確認了胃癌在腫瘤發(fā)生過程中癌細胞經(jīng)歷了全基因組范圍的大規(guī)模DNA去甲基化，特別是在重復元件LINE、SINE、LTR和Satellite等基因組區(qū)域DNA去甲基化幅度更大，并且在不同患者間和同一患者內(nèi)均具有強烈異質性。相比于結直腸癌，胃癌的基因組去甲基化幅度更大。其中，胃癌細胞基因組中LINE-1的DNA甲基化水平強烈下降，同時LINE-1編碼的ORF1p蛋白異常上調表達，提示部分逆轉錄轉座子LINE-1很可能在胃癌細胞中被異常激活轉錄和轉座，進而破壞基因組完整性。

該研究鑒定了多個患者共有的胃癌細胞特異高甲基化或特異性低甲基化的基因（啟動子區(qū)域），這些基因可作為候選的胃癌DNA甲基化標志物，例如異常高甲基化的TMEM240和HAGLROS基因的啟動子區(qū)域，以及異常低甲基化的TRPM2-AS和HRH1基因的啟動子區(qū)域。這一發(fā)現(xiàn)有望為胃癌的臨床診斷提供理論依據(jù)。

3、揭示了混合型胃癌癌細胞遺傳克隆、DNA甲基化亞群以及轉錄組亞群之間的復雜交互關系

鑒于混合型胃癌的腫瘤異質性極強，該研究采取多點取樣以及單細胞多組學測序方案，為探究混合型胃癌癌細胞的空間位置、遺傳克隆、DNA甲基化亞群以及基因表達亞的交互關系提供了堅實基礎。首先，通過染色體拷貝數(shù)變異模式準確鑒定同一個患者體內(nèi)的癌細胞的遺傳譜系，發(fā)現(xiàn)DNA甲基化亞群與遺傳克隆高度吻合，在同一個患者體內(nèi)同一個遺傳克隆內(nèi)的不同癌細胞的DNA甲基化水平相似，而不同遺傳克隆癌細胞的DNA甲基化水平常常差異很大。這說明全基因組去甲基化在胃癌遺傳克隆形成的時候已經(jīng)基本確立，而在后續(xù)的克隆擴張過程中可維持相對穩(wěn)定。

DNA甲基化的層次聚類分群與遺傳克隆一致

然而，同一個胃癌患者體內(nèi)癌細胞的遺傳克隆或者DNA甲基化亞群與轉錄組亞群之間并非簡單的一一對應關系，同一個遺傳克隆的癌細胞可以對應多個轉錄組亞群，不同遺傳克隆的癌細胞也可以對應同一個轉錄組亞群。此外，混合型胃癌呈現(xiàn)出強烈的空間異質性，不僅同一患者不同取樣位置包含的癌細胞遺傳克隆、DNA甲基化亞群和轉錄組亞群可以存在差異，同一取樣位置內(nèi)部也可以含有多個不同的遺傳克隆、DNA甲基化亞群或轉錄組亞群。

遺傳譜系、轉錄組亞群和取樣位置的對應情況

4、聯(lián)合單細胞多組學數(shù)據(jù)分析、多點取樣及點對點組織病理學分析精準鑒定混合型胃癌不同分化狀態(tài)癌細胞的多個組學層面的關鍵分子特征及免疫微環(huán)境特點

該研究通過分析不同胃癌轉錄組亞群的特征基因，鑒定出每個轉錄組亞群癌細胞的分化狀態(tài)，包括腺癌、神經(jīng)內(nèi)分泌癌和肝樣胃癌，并且與同一采樣位點的病理分析結果基本吻合。此外，將腺癌進一步細分為不同的分化程度（高分化、中分化和低分化）是一件頗具挑戰(zhàn)性的工作，主要原因包括：（1）由于胃癌患者間異質性強烈，目前仍缺乏已知、通用的可用于鑒定腺癌內(nèi)部不同分化程度腫瘤的標志基因；(2) 盡管每個取樣部位的病理分析結果可以提供有力證據(jù)，但同一個取樣部位內(nèi)部依然可能存在空間異質性。針對這一問題，該研究充分發(fā)揮多點取樣、同一采樣位點病理分析及單細胞多組學數(shù)據(jù)分析的聯(lián)合優(yōu)勢，在UMAP分群受患者間異質性影響較大的情況下，采用PCA的PC3軸將每個混合型胃癌患者體內(nèi)癌細胞的不同分化狀態(tài)的轉錄組亞群區(qū)分開，包括區(qū)分腺癌內(nèi)部不同的分化程度（高分化、中分化和低分化），并與同一采樣位點的病理分析結果基本吻合。

對混合型胃癌患者單細胞轉錄組數(shù)據(jù)的PCA降維結果

在準確鑒定癌細胞不同分化狀態(tài)的基礎上，該研究進一步探究了不同分化狀態(tài)癌細胞的分子特征。結果發(fā)現(xiàn)，粘蛋白家族成員MUC1在中分化和高分化腺癌中高表達，在每個患者體內(nèi)隨著分化狀態(tài)變差其表達量顯著降低。纖連蛋白FN1在分化狀態(tài)較差（神經(jīng)內(nèi)分泌癌和肝樣胃癌）的癌細胞中表達量顯著升高。并且，基因啟動子區(qū)域染色質可及性和DNA甲基化的改變可以部分解釋部分基因在不同分化狀態(tài)間表達水平的差異。此外，盡管胃癌分化狀態(tài)的特征基因在患者間表現(xiàn)出強烈異質性，卻可以匯聚到一些共性的信號通路上。例如，每個患者體內(nèi)分化狀態(tài)較差的癌細胞上調的基因富集在細胞周期、應激反應等相關通路，而每個患者體內(nèi)分化狀態(tài)較好的癌細胞上調的基因富集在免疫相關通路。

MUC1和FN1蛋白的免疫組化結果。ADC，腺癌；NEC，神經(jīng)內(nèi)分泌癌；HAS，肝樣胃癌

該研究發(fā)現(xiàn)，對于多數(shù)混合型胃癌患者（5/6）的原發(fā)灶癌細胞，分化狀態(tài)較差的癌細胞的全基因組DNA甲基化水平顯著高于分化狀態(tài)較好的癌細胞，但仍低于正常胃上皮細胞。該結果提示胃癌在腫瘤發(fā)生早期發(fā)生的大規(guī)模全基因組去甲基化使得以LINE-1為代表的重復序列被異常轉錄，激活了胃癌細胞作為上皮細胞的抗原遞呈特性，使得免疫細胞可以識別這些癌細胞。而在這些癌細胞進一步去分化或者轉分化（變成神經(jīng)內(nèi)分泌癌或者肝樣胃癌）過程中其全基因組甲基化水平部分回調，可能部分抑制了重復序列的異常轉錄，降低了癌細胞的抗原遞呈特性，從而使得免疫細胞更難識別和攻擊這些低分化或者轉分化的癌細胞。

每個胃癌患者體內(nèi)不同分化狀態(tài)的原發(fā)灶癌細胞的全基因組DNA甲基化水平

通過在同時含有腺癌和非腺癌的混合型胃癌內(nèi)部進行比較，發(fā)現(xiàn)非腺癌（神經(jīng)內(nèi)分泌癌和肝樣胃癌）內(nèi)部的CD8⁺T細胞浸潤水平較低，CD8⁺T細胞主要存在于腫瘤邊緣，呈現(xiàn)出免疫排斥型的免疫微環(huán)境特征。相反，腺癌內(nèi)部的CD8⁺T細胞浸潤水平相對較高。相應地，腺癌部分的免疫相關通路評分也顯著高于非腺癌（神經(jīng)內(nèi)分泌癌和肝樣胃癌）部分。

一例代表性的混合性腺神經(jīng)內(nèi)分泌癌的CD8免疫組化結果

總之，該研究通過對胃癌根治手術標本中配對的癌旁、原發(fā)灶、淋巴結轉移灶進行系統(tǒng)性多點采樣和單細胞多組學（基因組、DNA甲基化組、染色質狀態(tài)組以及轉錄組）測序分析，揭示了不同胃癌患者癌細胞基因表達異常的共性規(guī)律，發(fā)現(xiàn)不同分型的胃癌都普遍高表達腸上皮細胞特異性基因，這反映了胃癌細胞在失去正常生理功能的去分化過程中其可塑性也普遍增加。系統(tǒng)繪制了胃癌的單細胞DNA甲基化圖譜，發(fā)現(xiàn)胃癌與結直腸癌類似，在腫瘤發(fā)生過程中其癌細胞經(jīng)歷了全基因組范圍的大規(guī)模DNA去甲基化，同時少量基因的啟動子區(qū)域發(fā)生DNA甲基化異常上調；發(fā)現(xiàn)與結直腸癌類似，在同一胃癌中同一個遺傳克隆內(nèi)的不同癌細胞的DNA甲基化水平相似，而不同遺傳克隆癌細胞的DNA甲基化水平常常差異很大。這說明全基因組DNA去甲基化在胃癌腫瘤發(fā)生相對早期的階段就完成了，并在此后每個遺傳克隆的擴張過程中基本維持不變。發(fā)現(xiàn)同一胃癌中癌細胞的遺傳克隆或者DNA甲基化亞群與轉錄組亞群之間并非簡單的一一對應關系，同一個遺傳克隆的癌細胞可以對應多個轉錄組亞群，不同遺傳克隆的癌細胞也可以對應同一個轉錄組亞群；發(fā)現(xiàn)在混合型胃癌中，相比于分化狀態(tài)較好的癌細胞，分化狀態(tài)較差（例如神經(jīng)內(nèi)分泌癌、肝樣胃癌）的癌細胞部分回調全基因組甲基化，上調細胞周期、應激反應等相關通路基因，下調免疫相關通路基因，免疫浸潤水平較低。

北京大學卞舒惠博士（現(xiàn)為南京醫(yī)科大學生殖醫(yī)學國家重點實驗室教授）、王藝橙博士、周圓博士為本文共同第一作者，湯富酬和北京大學第三醫(yī)院周鑫副研究員為本文的共同通訊作者。該研究工作得到國家自然科學基金委員會、北京未來基因診斷高精尖創(chuàng)新中心、北大-清華生命科學聯(lián)合中心等經(jīng)費資助。

來源： 生物醫(yī)學前沿創(chuàng)新中心