乳腺癌是女性中最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生發(fā)展受到細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的調(diào)節(jié)。ECM是一種復(fù)雜的多聚物網(wǎng)絡(luò)，包含多種結(jié)構(gòu)和功能蛋白。ECM不僅提供了細(xì)胞生長和分化所需的物理支架和化學(xué)信號(hào)，還通過改變其生化組成或力學(xué)特性來影響細(xì)胞行為。ECM與細(xì)胞之間的信息交流主要通過粘附斑（FAs）來實(shí)現(xiàn)，F(xiàn)As是一種動(dòng)態(tài)的蛋白質(zhì)組裝體，負(fù)責(zé)機(jī)械信號(hào)的感知和轉(zhuǎn)導(dǎo)。當(dāng)ECM與跨膜異二聚體整合素受體結(jié)合時(shí)，F(xiàn)As內(nèi)部會(huì)招募眾多蛋白組分，并與肌動(dòng)蛋白骨架相連。隨著ECM剛度的增加，細(xì)胞通過肌動(dòng)蛋白聚合和肌動(dòng)蛋白馬達(dá)主動(dòng)增強(qiáng)對抗性的收縮和張力。將機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)化為生化信號(hào)，調(diào)節(jié)細(xì)胞行為。

乳腺癌相關(guān)組織表現(xiàn)出比正常乳腺組織更高的剛度。目前已經(jīng)廣泛認(rèn)識(shí)到，高硬度的ECM促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲。然而，ECM機(jī)械特性的變化如何轉(zhuǎn)化為指導(dǎo)細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移的生化信號(hào)仍然知之甚少。

2023年10月17日，王波教授和圣裘德兒童研究醫(yī)院Mondira Kundu教授團(tuán)隊(duì)在EMBO Reports上發(fā)表了題為“An ULK1/2-PXN mechanotransduction pathway suppresses breast cancer cell migration”的研究成果。該研究表明自噬誘導(dǎo)激酶ULK1以不依賴自噬的方式磷酸化PXN/Paxillin S32和S119位點(diǎn)，從而破壞Paxillin相分離能力并阻礙黏著斑的組裝，最終抑制細(xì)胞的黏附和遷移。本文揭示了ULK1/2作為PXN的重要調(diào)節(jié)因子在機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)中的新功能，也為乳腺癌的診斷和治療提供了新的靶點(diǎn)。

為了探索 ECM、機(jī)械傳導(dǎo)和自噬之間的關(guān)系，作者首先分析了乳腺癌患者組織和正常組織的蛋白質(zhì)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)腫瘤樣本中某些 ECM 蛋白（包括膠原蛋白和纖連蛋白）、細(xì)胞收縮和整合素信號(hào)傳導(dǎo)的幾種標(biāo)志物水平升高，而自噬活性的幾個(gè)關(guān)鍵蛋白中只有ULK1顯著下調(diào)。隨后利用單細(xì)胞RNA測序數(shù)據(jù)，作者比較了正常和惡性乳腺上皮細(xì)胞的基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與FA和細(xì)胞皮層相關(guān)的基因顯著上調(diào)。為了檢測乳腺癌細(xì)胞中ULK1水平降低與機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的異常激活是否相關(guān)，作者分別構(gòu)建了回補(bǔ)空載（EV）、ULK1野生型（WT )、ULK1激酶失活型 (KD) 的MDA-MB-231和Hela細(xì)胞系，并通過Transwell實(shí)驗(yàn)證明ULK1 WT（而非ULK1 KD）能顯著阻礙細(xì)胞遷移。與之相對應(yīng)的，作者同樣檢測到該組細(xì)胞鋪展的延遲、FA的組裝、整合素下游信號(hào)的抑制、牽引力顯微鏡（TFM）檢測的細(xì)胞收縮力減弱以及原子力顯微鏡 (AFM) 測量的細(xì)胞硬度降低等現(xiàn)象，這些結(jié)果共同證明了ULK1作為細(xì)胞遷移和收縮的負(fù)調(diào)控因子，阻礙肌動(dòng)蛋白的組裝和機(jī)械力的轉(zhuǎn)導(dǎo)。

圖1 ULK1/2抑制細(xì)胞鋪展與FA的組裝

為了探究 ULK1/2 發(fā)揮這些功能的分子機(jī)制，作者將目光聚焦到PXN，一種被充分研究的FA接頭蛋白，在果蠅中已被證明與ULK1/2存在遺傳相互作用。作者也在HEK293T細(xì)胞中通過免疫沉淀實(shí)驗(yàn)檢測到ULK1和PXN存在相互作用，同時(shí)在Hela細(xì)胞中能夠觀察到它們存在很好的共定位?？紤]到與 ULK1/2 相互作用的蛋白質(zhì)通常是這些激酶的直接底物，作者通過體外激酶實(shí)驗(yàn)證明了ULK1能夠在S32和S119位點(diǎn)直接磷酸化PXN。ULK1介導(dǎo)的PXN磷酸化的具體功能是什么？作者發(fā)現(xiàn)回補(bǔ)PXN WT，尤其是回補(bǔ)磷酸化缺陷型 2SA，可以顯著恢復(fù)PXN敲除對細(xì)胞遷移和機(jī)械力轉(zhuǎn)導(dǎo)造成的影響，而回補(bǔ)磷酸化模擬型2SD組則幾乎不能做到。綜上所述，這些結(jié)果表明 ULK1/2 對 PXN 的磷酸化能抑制細(xì)胞力學(xué)，而細(xì)胞力學(xué)的功能障礙會(huì)促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移。

圖2 ULK1/2對PXN的磷酸化阻礙乳腺癌細(xì)胞機(jī)械力的轉(zhuǎn)導(dǎo)

鑒于作者未發(fā)表的數(shù)據(jù)，表明PXN通過液-液相分離（LLPS）促進(jìn)胞質(zhì)FA復(fù)合物的大分子組裝，作者假設(shè)ULK1介導(dǎo)的PXN磷酸化可能會(huì)影響PXN LLPS。所以作者利用體外/體內(nèi)蛋白相分離、光漂白后熒光恢復(fù) (FRAP)和雙磺基琥珀酰亞胺基辛二酸酯 (BS³)交聯(lián)等實(shí)驗(yàn)，證明了該磷酸化通過削弱PXN同型相互作用，減慢分子熱力學(xué)，因此增加 其LLPS 的閾值，從而導(dǎo)致 FA 組裝/成熟受阻。

圖3 ULK1/2對PXN的磷酸化減弱其相分離能力

隨后的研究還表明，絲氨酸激酶ULK1/2和酪氨酸激酶FAK/Src通過競爭性磷酸化在力傳導(dǎo)中發(fā)揮拮抗作用。在體外和細(xì)胞中，一種激酶（ULK1/2或FAK/Src）對顯著減弱了另一種激酶（FAK/Src或ULK1/2）對 PXN 的磷酸化。作者認(rèn)為兩類激酶的這種精細(xì)的調(diào)節(jié)機(jī)制可能反映了細(xì)胞中控制機(jī)械傳感與轉(zhuǎn)導(dǎo)的復(fù)雜程序。

本研究詳細(xì)描述了自噬誘導(dǎo)絲氨酸/蘇氨酸激酶ULK1和ULK2在機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)中的新作用。作者發(fā)現(xiàn)ULK1/2活性抑制肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維和粘著斑(FA)的組裝，從而阻礙細(xì)胞收縮和遷移，與其在自噬中的作用無關(guān)。從機(jī)制上講，作者將PXN/paxillin（力傳導(dǎo)機(jī)制的關(guān)鍵組成部分）確定為ULK1/2的直接結(jié)合分子和底物。ULK1/2介導(dǎo)的PXN在S32和S119處的磷酸化削弱了PXN的同型相互作用和液-液相分離，損害FA組裝，進(jìn)而改變?nèi)橄侔┘?xì)胞的機(jī)械特性及其對機(jī)械刺激的反應(yīng)。ULK1/2和被充分研究的PXN調(diào)節(jié)因子FAK/Src在機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)方面具有相反的功能，并競爭相鄰絲氨酸和酪氨酸殘基的磷酸化。綜上所述，作者的研究表明ULK1/2是PXN依賴性機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要調(diào)節(jié)因子，并且首次證明了翻譯后修飾與 LLPS、FA動(dòng)力學(xué)、機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)和腫瘤轉(zhuǎn)移之間的因果關(guān)系，為調(diào)節(jié)FA（膜相關(guān)縮合物）的材料特性來治療乳腺癌提供新的視角。

圖4 ULK1/2磷酸化PXN抑制細(xì)胞機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)的激活

王波教授和圣裘德兒童研究醫(yī)院Mondira Kundu教授為該論文的共同通訊作者，廈門大學(xué)細(xì)胞應(yīng)激國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室博士后梁沛鋼，在讀博士生張佳琪，已畢業(yè)碩士生吳宇晨和在讀碩士生鄭善元為論文的共同第一作者。該研究得到國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目等的資助。

全文鏈接：https://www.embopress.org/doi/full/10.15252/embr.202356850

（圖/文 王波課題組）

來源：廈門大學(xué)