今天要給大家分享一篇應(yīng)用GEO/TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘CRC早期診斷和良好預(yù)后的循環(huán)外泌體miRNA生物標(biāo)志物的策略。文章研究思路主要是在discovery階段通過(guò)對(duì)已有TCGA/GEO數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行整合分析，從而鑒定出候選循環(huán)外泌體miRNA，接著進(jìn)行了training、validation和external validation實(shí)驗(yàn)，通過(guò)qRT-PCR、ROC曲線(xiàn)分析、Kaplan-Meier方法確定了循環(huán)外泌體miR-27a和miR-130a可作為結(jié)直腸癌早期診斷與良好預(yù)后的生物標(biāo)記物。
GEO/TCGA數(shù)據(jù)挖掘：外泌體miRNA輕松發(fā)4.5分Biomarker Paper-肽度TIMEDOO

? 研究背景 ?

結(jié)直腸癌（CRC）是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的癌癥之一，由于診斷時(shí)已進(jìn)入晚期，通常預(yù)后都較差。miRNA是腫瘤早期診斷和預(yù)后評(píng)估最有潛力的分子生物標(biāo)志物之一。之前大多數(shù)關(guān)于miRNA生物標(biāo)志物的研究都集中在組織標(biāo)本上，有研究表明血清外泌體miRNA可作為人類(lèi)許多癌癥（如CRC）診斷和復(fù)發(fā)的新型生物標(biāo)志物。然而，關(guān)于循環(huán)外泌體miRNA表達(dá)譜與CRC診斷及預(yù)后的關(guān)系仍然不清楚。本研究旨在探討特異性循環(huán)外泌體miRNAs是否可作為CRC早期診斷的生物標(biāo)志物。
? 實(shí)驗(yàn)方法 ?
在discovery階段，通過(guò)對(duì)兩個(gè)GEO數(shù)據(jù)集和TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行整合分析，選擇候選的循環(huán)外泌體miRNAs。在隨后的training、validation和external validation階段，使用qRT-PCR和ROC曲線(xiàn)分析鑒定和驗(yàn)證miRNAs的差異表達(dá)和診斷效用。采用Kaplan-Meier方法研究循環(huán)外泌體miRNAs的預(yù)后。
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圖1. 四個(gè)階段實(shí)驗(yàn)方法
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圖2. 整體研究路線(xiàn)示意圖

? 研究結(jié)果 ?

1、循環(huán)外泌體miR-27a和miR-130a作為CRC新型潛在診斷生物標(biāo)志物（Discovery階段）
首先，通過(guò)GEO數(shù)據(jù)集（GSE33961）對(duì)術(shù)后生存時(shí)間長(zhǎng)（≥5年）或短（＜5年）的CRC患者的miRNA表達(dá)進(jìn)行全面比較分析。在生存時(shí)間短的患者中發(fā)現(xiàn)了46個(gè)上調(diào)和5個(gè)下調(diào)的miRNAs。接下來(lái)，進(jìn)一步在TCGA結(jié)腸腺癌[COAD]數(shù)據(jù)集中驗(yàn)證這些失調(diào)的miRNAs。發(fā)現(xiàn)只有8個(gè)miRNAs顯示出一致的結(jié)果，與CRC患者預(yù)后顯著相關(guān)。
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為了研究循環(huán)外泌體miRNA的診斷作用，進(jìn)一步分析了另一個(gè)GEO數(shù)據(jù)集（GSE39833）。發(fā)現(xiàn)與CRC患者預(yù)后顯著相關(guān)的8個(gè)miRNAs中，只有miR-27a和miR-130a顯著失調(diào)。GSE39833的數(shù)據(jù)顯示循環(huán)外泌體miR-27a和miR-130a是CRC的新型潛在診斷生物標(biāo)志物。
2、miR-27a和miR-130a在CRC早期檢測(cè)中的表現(xiàn)（Training階段）
接著，對(duì)40名I期CRC患者和40名健康受試者進(jìn)行隊(duì)列研究，發(fā)現(xiàn)I期CRC患者血漿外泌體miR-27a和miR-130a的相對(duì)表達(dá)顯著高于健康對(duì)照組。ROC曲線(xiàn)分析表明了血漿外泌體miR-27a和miR-130a在CRC早期檢測(cè)中的診斷作用。
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3、在不同分期CRC患者中進(jìn)行驗(yàn)證（validation階段）
然后，通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)40名健康受試者、40名I期CRC患者、20名II期CRC患者、14名III期CRC患者和6名IV期CRC患者中miR-27a和miR-130a的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)CRC患者血漿外泌體miR-27a和miR-130a的相對(duì)表達(dá)顯著高于健康對(duì)照組。ROC曲線(xiàn)分析驗(yàn)證了血漿外泌體miR-27a和miR-130a可用于不同分期CRC患者的診斷。
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4、腺瘤患者的External validation階段
接下來(lái)，進(jìn)行了由50名I期CRC患者、50名腺瘤患者和50名健康受試者組成的更大隊(duì)列研究。發(fā)現(xiàn)CRC患者血漿外泌體miR-27a和miR-130a的相對(duì)表達(dá)顯著高于腺瘤患者和健康對(duì)照組。ROC曲線(xiàn)分析結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了循環(huán)外泌體miR-27a和miR-130a在CRC早期檢測(cè)中的作用。
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5、循環(huán)外泌體miR-27a和miR-130a是腫瘤衍生的miRNAs
為了確定miR-27a和miR-130a是癌細(xì)胞分泌進(jìn)入外周血的分泌miRNAs，對(duì)超離心后血漿和培養(yǎng)基樣品進(jìn)行了透射電子顯微鏡圖像（TEM）分析，捕獲直徑為40-100 nm的圓形微囊泡。然后對(duì)收集的15對(duì)術(shù)前和術(shù)后血漿外泌體標(biāo)本進(jìn)行qRT-PCR，發(fā)現(xiàn)CRC組織切除后循環(huán)外泌體miR-27a和miR-130a表達(dá)明顯下降（圖A）。此外，CRC細(xì)胞系培養(yǎng)基中的外泌體miR-27a和miR-130a顯著更高（圖B）。表明了循環(huán)外泌體miR-27a和miR-130a來(lái)源于腫瘤。
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6、血漿外泌體miR-27a和miR-130a的高表達(dá)與CRC患者預(yù)后不良相關(guān)
最后，本研究評(píng)估了循環(huán)外泌體miR-27a (miR-130a)與CRC患者臨床病理特征的相關(guān)性。相關(guān)回歸分析表明，外泌體miR-27a與TNM分期呈正相關(guān)，外泌體miR-130a與TNM分期以及組織學(xué)分級(jí)呈正相關(guān)。此外，使用Kaplan-Meier生存分析進(jìn)一步分析了CRC患者外泌體miR-27a (miR-130a)表達(dá)與臨床預(yù)后的相關(guān)性。結(jié)果表明，血漿外泌體miR-27a和miR-130a的高表達(dá)是總生存率差的新型潛在預(yù)測(cè)因子。
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參考文獻(xiàn)：Liu X, Pan B, Sun L, et al. Circulating exosomal miR-27a and miR-130a act as novel diagnostic and prognostic biomarkers of colorectal cancer[J].?Cancer Epidemiology and Prevention Biomarkers, 2018, 27(7): 746-754.
來(lái)源：銳博生物GEO/TCGA數(shù)據(jù)挖掘：外泌體miRNA輕松發(fā)4.5分Biomarker Paper-肽度TIMEDOO