結直腸癌（CRC）是最常見的惡性腫瘤之一，其主要死亡原因是腫瘤轉移。m6A是一種新興的基因表達調控機制，METTL3參與了多種癌癥類型的腫瘤進展。然而，它在CRC中的作用仍然不清楚。
2019年6月24日，中山大學腫瘤防治中心徐瑞華課題組在Molecular Cancer（IF10.679）期刊上發(fā)表了題為METTL3 facilitates tumor progression via an m6A-IGF2BP2-dependent mechanism in colorectal carcinoma的重要研究成果。首次證明了METTL3在促進CRC進展中的作用，并揭示了METTL3促進CRC進展的m6A-IGF2BP2依賴性機制，為CRC預后提供了更具預測價值的新潛在生物標志物組合（包括“writer”METTL3、“reader”IGF2BP2和“target”SOX 2）。
METTL3在CRC患者中高表達，導致SOX2轉錄本m6A甲基化水平升高。隨后，甲基化的SOX2被m6A“reader”IGF2BP2識別，以維持其mRNA的穩(wěn)定性和表達。最后，SOX2表達的增加通過SOX2的下游靶標促進CRC細胞的干性和轉移，導致CRC的進展。
??? 首先，采用Western blot、real-time PCR (RT-qPCR)和免疫組化(IHC)檢測METTL3在細胞株和患者組織中的表達。
??? 采用MeRIP-seq和轉錄組RNA測序(RNA-seq)篩選METTL3的靶基因。（由銳博生物提供測序服務）
??? METTL3體內/體外生物學功能研究。
??? 采用RNA pull-down和RNA免疫沉淀法研究靶基因的特異性結合。并采用RNA穩(wěn)定性分析檢測METTL3下游基因的半衰期。
1、METTL3在轉移性CRC中高表達，且與預后不良有關
研究人員為了評估CRC中m6A WERs ( writers, erasers，readers )的表達譜，通過TCGA數據庫發(fā)現METTL3、YTHDF1、YTHDF2、IGF2BP1、IGF2BP2在CRC腫瘤組織中顯著增加。其中METTL3在大多數人類癌癥中普遍高表達，因此本研究探索了METTL3在CRC中的功能和臨床意義。發(fā)現METTL3在復發(fā)性CRC組織和轉移性肝組織中持續(xù)升高，并且METTL3 mRNA和蛋白水平在CRC細胞系和CRC患者組織中明顯增加。
隨后，研究人員探索了METTL3與CRC的臨床意義，IHC實驗發(fā)現原發(fā)性CRC組織中METTL3染色增加。同樣，METTL3在匹配的淋巴結和肝轉移灶中也顯著升高。并且發(fā)現METTL3高表達的患者從標準化療中獲益較差。此外，METTL3高表達的CRC患者總生存期(OS)和無進展生存期(DFS)均較短，表明METTL3表達可以作為CRC患者OS和DFS的預后標志物。
2、SOX2受METTL3介導的m6A修飾調節(jié)
為了研究METTL3在腫瘤進展中的潛在作用，研究人員首先注意到分別從單個患者的腹部轉移灶和原發(fā)腫瘤分離出的SW620和SW480細胞系表現出不同的轉移能力，并且與SW480細胞相比，SW620細胞中的METTL3水平升高，這表明METTL3與轉移之間存在一定的聯(lián)系。因此，研究人員對SW480、SW620和METTL3敲低的SW620細胞進行MeRIP-seq（由銳博生物提供）和RNA-seq，發(fā)現與SW480細胞相比，SW620細胞中有733個高甲基化的m6A峰，其mRNA表達水平較高，稱為轉移相關的超高峰；METTL3敲低的SW620細胞中有3393個低甲基化m6A峰，其mRNA表達較低，稱為METTL3相關的低下峰。兩組峰共同擁有192個特定峰，對應158個基因，主要富集在干細胞分化通路，說明該通路可能受METTL3調控，通過m6A機制促進腫瘤轉移。
接著，從m6A-seq數據中篩選了4個干細胞分化通路中的基因：SEMA3A、BCHE、ZFP36L2和SOX2。基因特異性m6A pull down實驗和qPCR分析表明：與SW480細胞相比，SW620細胞中SOX2、ZFP36L2和SEMA3A的m6A水平增加。然而，與對照組相比，在METTL3敲低CRC細胞中，SOX2表現出最一致的m6A和mRNA水平的下降。此外，在SW620和HCT116細胞中，METTL3抑制后，SOX2蛋白水平顯著降低。考慮到SOX2被認為是促進腫瘤發(fā)生和參與腫瘤轉移的重要CSC標志物，推測METTL3以m6A依賴性方式促進CRC的干性和轉移，從而維持SOX2的表達。
為了驗證以上推測，研究人員通過實驗發(fā)現METTL3抑制的SW620和HCT116細胞中的球體數量和大小減少、干細胞發(fā)生率顯著降低，細胞集落形成和侵襲能力也受到損害。并且METTL3敲低的SW620和HCT116細胞對基于奧沙利鉑的化療敏感性增加。此外，還發(fā)現METTL3抑制后，CSC表面抗原如CD133、CD44、上皮細胞粘附分子(EpCAM)在SW620和HCT116細胞中的表達顯著降低。SOX2下游基因CCND1、MYC和POU5F1的表達在METTL3敲低的SW620和HCT116細胞中被一致地抑制。從而揭示了METTL3的致癌作用，特別是在促進CRC細胞的腫瘤自我更新、細胞侵襲和化療耐藥方面。而在METTL3敲低和對照CRC細胞中過表達SOX2則可使球體形成增加，并出現明顯的化療耐藥表型。表明METTL3通過維持CRC中SOX2的表達，在促進干細胞特性方面發(fā)揮了重要作用。
4、METTL3在體內驅動CRC的腫瘤發(fā)生和轉移
接下來，研究人員通過皮下異種移植試驗以確定METTL3在體內的功能。發(fā)現植入METTL3敲低的SW620和HCT116細胞時，腫瘤生長速度較慢，異種移植腫瘤重量減少。此外，與尾靜脈注射METTL3敲低細胞的小鼠相比，注射對照SW620細胞的小鼠表現出更多的肺轉移性結節(jié)。值得注意的是，在METTL3敲低的SW620細胞中，致瘤性CRC細胞的發(fā)生率顯著降低。此外，SOX2過表達增加了對照和METTL3敲低SW620細胞中腫瘤發(fā)生率和致瘤細胞的頻率。表明METTL3通過維持CRC中的SOX2表達促進腫瘤發(fā)生和轉移灶的形成。
隨后，通過兩種PDX模型來評估METTL3通過腫瘤內RNAi注射的潛在治療效果。發(fā)現METTL3 siRNA治療組腫瘤體積明顯低于對照組。此外，分離PDX腫瘤并進行IHC染色評估，發(fā)現METTL3 siRNA治療組中METTL3、SOX2和EpCAM表達的染色減少。進一步強調了METTL3在體內CRC腫瘤發(fā)生和轉移中的重要作用。
5、IGF2BP2通過m6A依賴性方式增強SOX2 mRNA穩(wěn)定性
為了闡明SOX2的特異性m6A readers，并確定SOX2調節(jié)的m6A依賴性機制，研究人員通過RNA pull-down來篩選SOX2相關的m6A readers。發(fā)現IGF2BP2在SW620和HCT116細胞中特異性地結合了SOX2全長轉錄本。值得注意的是，IGF2BP2主要結合于SOX2 CDS區(qū)域，且在m6A motif缺失后，特異性結合受到顯著損害。RIP實驗也證實了IGF2BP2和SOX2 mRNA直接相互作用。TCGA數據庫分析發(fā)現IGF2BP2和SOX2表達正相關，暗示其潛在的正向調控機制。隨后，研究人員通過siRNA抑制IGF2BP2后，發(fā)現SOX2蛋白和mRNA表達顯著降低，且SOX2下游基因的表達也降低。此外，抑制METTL3可導致IGF2BP2和SOX2轉錄本之間的直接相互作用受損。
此外，研究人員評估了METTL3或IGF2BP2抑制的CRC細胞及對照細胞中的RNA衰變速率。發(fā)現當METTL3或IGF2BP2抑制時，SOX2 mRNA表達開始降低并且SOX2 mRNA半衰期持續(xù)顯著縮短。表明甲基化的SOX2轉錄本被m6A“reader”IGF2BP2（可保持轉錄本的穩(wěn)定性以防止其降解）直接識別，并通過m6A-IGF2BP2依賴性機制自然地增加其表達。
6、CRC中METTL3、SOX2和IGF2BP2的臨床相關性
最后，為了探索METTL3、IGF2BP2和SOX2的臨床相關性，研究人員通過IHC實驗發(fā)現CRC組織中SOX2和IGF2BP2表達均顯著升高，Kaplan-Meier生存分析表明高表達SOX2和IGF2BP2與較短的總生存期和無進展生存期時間顯著相關。值得注意的是，SOX2在CRC組織中的表達與METTL3和IGF2BP2呈正相關。此外，METTL3或IGF2BP2表達與SOX2下游基因CCND1、MYC、POU5F1也呈正相關。采用Cox回歸分析METTL3、SOX2和IGF2BP2均顯著增加了死亡的危險比(HR)，表明這三個基因是獨立的預后因素。
接著，研究人員生成一個含有METTL3、SOX2和IGF2BP2的新IHC panel來預測CRC的預后。Kaplan-Meier生存分析表明，具有三種高表達標志物的患者的總生存期和無進展生存期最短。此外，ROC曲線分析發(fā)現與任何單個標記相比，新IHC panel（METTL3、SOX2和IGF2BP2）顯示出總體生存率的可加性預測值。
總之，該研究結果顯示了作為致癌基因的METTL3通過CRC細胞中的m6A-IGF2BP2依賴性機制維持SOX2表達，并且揭示了一個用于CRC預后預測的潛在生物標志物組。
原文：Li T, Hu P S, Zuo Z, et al. METTL3 facilitates tumor progression via an m 6 A-IGF2BP2-dependent mechanism in colorectal carcinoma[J]. Molecular cancer, 2019, 18(1): 112.
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