行研 | 呼氣檢測：從辨味識病到代謝組分析的標(biāo)準(zhǔn)化之路-肽度TIMEDOO

本文作者：Patrick

呼氣檢測起源辨味識病
第一個用于確定人類生理狀態(tài)的呼吸分析起源于希波克拉底時期（公元前460-370年），當(dāng)時古希臘醫(yī)生意識到可以從患者呼吸的特征氣味中診斷出某些疾病，并且知道人的呼吸可能會提供有關(guān)健康狀況的健全信息。在后來的醫(yī)學(xué)實踐中，醫(yī)生能夠很容易分辨出糖尿病患者、晚期肝病患者、腎衰竭患者和肺膿腫患者呼吸中的“水果味”（丙酮）、“霉味”、“魚腥味”、“尿味”和“腐臭味”[1]。對呼出氣中存在的VOCs的分析可以提供患者病理生理狀況的寶貴信息，這些化合物是各種疾病和代謝活動的潛在診斷生物標(biāo)志物。
圖一 呼出氣成分示意圖

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來源：Owlstonemedical.com
高精度分析質(zhì)譜儀的出現(xiàn)極大促進(jìn)呼氣檢測科研發(fā)展
近代提出呼氣代謝組學(xué)（breath metabolomics）的概念，當(dāng)發(fā)生從健康狀態(tài)到病理狀態(tài)的轉(zhuǎn)變時，人體呼氣中的揮發(fā)性有機(jī)物( volatile organic compounds，VOCs)分布將被改變，并且可以被檢測到并用于診斷和監(jiān)測。從1970年代Pauling團(tuán)隊使用氣相色譜儀（GC）檢測人類呼吸中200多種VOCs之后，越來越多科研團(tuán)隊在研究呼氣代謝組學(xué)。
圖二 1980~2015年間呼出氣VOCs發(fā)表文章數(shù)統(tǒng)計

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來源：breath biopsy complete guide
呼氣中揮發(fā)性有機(jī)化合物的來源包括環(huán)境（稱為外源性），宿主（內(nèi)源性）以及微生物組（居住于口腔，肺和腸道的微生物）。而宿主產(chǎn)生的VOCs是與臨床疾病相關(guān)中研究最多的，用于診斷目的的呼氣VOCs主要包括含：
表一 呼氣VOCs的化合物分類[2]

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呼氣檢測已經(jīng)在臨床應(yīng)用，更多檢項仍待開發(fā)
在臨床實踐中已經(jīng)建立了一些使用揮發(fā)性生物標(biāo)志物的呼氣檢測。但由于尋找疾病生物標(biāo)志物的研究之間缺乏可重復(fù)性，VOCs檢測在臨床應(yīng)用中沒有得到充分開發(fā)。
表二 已經(jīng)實際使用的呼氣檢測項目

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來源：Johns Hopkins medicine、奇跡之光整理
腫瘤和感染性疾病篩查診斷是呼氣檢測未來的發(fā)展方向
在病理生理過程中，細(xì)胞代謝的改變會導(dǎo)致生化反應(yīng)副產(chǎn)物VOCs的變化。包括缺氧、細(xì)胞過度增殖、過度的炎癥和活性氧活性以及其他與癌癥相關(guān)的病理機(jī)制都會導(dǎo)致局部和系統(tǒng)性VOCs的譜圖和濃度發(fā)生明顯變化。生物學(xué)家已提出了幾種潛在的生化途徑機(jī)制。例如，由于缺氧和/或炎性疾病，在癌癥的微環(huán)境中的氧化應(yīng)激有助于烷烴和甲基化烷烴的形成。癌癥患者中細(xì)胞色素P450酶的過度活化可能會提高酒精水平。由局部缺氧引起的過度細(xì)胞增殖導(dǎo)致無氧呼吸，其中能量產(chǎn)生的糖酵解途徑釋放出酮和醇。
在眾多研究中也發(fā)現(xiàn)在肺癌中呼氣VOCs與體外細(xì)胞系中的VOCs部分重疊。表明除了癌細(xì)胞直接釋放的VOC外，與疾病本身相關(guān)的繼發(fā)性和/或全身性機(jī)制也會產(chǎn)生，這意味著VOCs作為標(biāo)志物可以更全面的對人體生理病理狀態(tài)做出判斷[3]。
現(xiàn)已知253種VOCs與不同腫瘤部位的癌癥診斷有關(guān)，在大多數(shù)情況下，這些揮發(fā)性有機(jī)化合物主要是碳?xì)浠衔铮ǚ枷阕搴椭咀澹┖秃趸衔铮慈⒋?、酚、羧酸、醚和呋喃），而含氮、硫和鹵素的化合物較少。其中與癌癥相關(guān)的最常見的是2-丁酮、1-丙醇、壬醛、異戊二烯、乙苯、4-甲基辛烷、3-羥基-2-丁酮、丙酮、甲苯、乙醇、戊醛、庚醛和戊烷等[4]。
表三 腫瘤患者呼出氣VOCs的臨床一期研究（不完全統(tǒng)計）[4]

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多項研究表明檢測呼吸中的VOCs指紋圖譜或化學(xué)基團(tuán)可將患有微生物感染的個體與健康對照區(qū)分開[5]。由于細(xì)菌獨有的新陳代謝產(chǎn)物是人類自身無法產(chǎn)生的，其中細(xì)菌特異性VOCs可以作為標(biāo)志物進(jìn)行診斷。比如膿毒癥常見的六種菌（金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、糞腸球菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌和大腸桿菌）均產(chǎn)生異戊醇、甲醛、甲硫醇和三甲胺。而這六種菌株又各自產(chǎn)生特異性的金黃色葡萄球菌的異戊酸和2-甲基丁醛；用于銅綠假單胞菌的1-十一碳烯、2-丁酮以及大腸桿菌的甲醇、戊醇、乙酸乙酯和吲哚等[6]。
對于病原感染來說現(xiàn)有很多檢測方法，但是各有各的優(yōu)缺點。常用的急性感染蛋白標(biāo)志物有CRP、PCT和SAA等，這類檢測的優(yōu)點是快速便宜，但是無法精準(zhǔn)辨別感染的菌種類別。而新晉的核酸檢測包括PCR、mNGS等優(yōu)點是可以對感染菌種準(zhǔn)確分型，且可以分析耐藥信息以獲得更好的用藥指導(dǎo)及預(yù)后。但是檢測周期較長，對不同感染類別的取樣及樣本類型要求復(fù)雜多變以及價格較高是限制臨床全覆蓋的重要因素。因此一個檢測方便快捷、價格便宜且可以對菌種分型鑒定的呼氣檢測有其獨特的臨床優(yōu)勢。
表四 部分感染性疾病及其潛在VOCs

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來源：奇跡之光-文章整理
樣本采集的標(biāo)準(zhǔn)化可以提高檢測結(jié)果的重現(xiàn)性
宿主和共生微生物的內(nèi)源性VOCs相互作用大大增加了呼氣代謝組的復(fù)雜性，而且呼氣中VOCs含量通常非常稀少，低至百萬分之幾（ppmv）甚至十億分之幾（ppbv），因此要實現(xiàn)可靠、高質(zhì)量、標(biāo)準(zhǔn)化的呼吸采樣及分析檢測存在相當(dāng)?shù)奶魬?zhàn)。
圖三 呼氣采集流程[7]

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樣品預(yù)濃縮方法與高靈敏度的分析儀器至關(guān)重要，樣本采集核心是采集到不包含環(huán)境氣體成分的內(nèi)源性氣體，以供精確分析和避免干擾因素。
一次連續(xù)的呼氣根據(jù)CO2分壓分為四個時項相，分別是死腔通氣、死腔通氣及肺泡內(nèi)氣體體混合過渡期、肺泡氣和呼氣末期。相比于階段Ⅱ和階段Ⅲ的混合采樣來說，階段Ⅲ的采樣更具有代表性，且避免了引入外源性氣體帶來的檢測結(jié)果假陽性。采樣的原則是在獲取呼吸樣本時需要嚴(yán)格控制流程并保證采樣可重現(xiàn)。
圖四 時間-二氧化碳分壓波形圖[7]

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樣本預(yù)濃縮有助于提高檢測性能，但帶來樣本損耗及重現(xiàn)性差
由于傳統(tǒng)的分析方法限制，需要對樣本進(jìn)行預(yù)濃縮以提高分析精度，同時也一定程度降低分離純化過程中會帶來的巨大損耗。常見的氣體樣本濃縮方法有熱脫附（TD）管和固相微萃?。⊿PME）。
熱脫附管用吸附劑把氣體吸附富集，再通過加熱的方式解吸附釋放到檢測儀器中。常用的吸附劑包括Tenax TA & GR、Carbograph 5TD、碳分子篩（Carboxen）等。為了防止分析物的過度吸附損失導(dǎo)致失去一些痕量的潛在VOCs標(biāo)志物，對挑選吸附材料也極為講究。但無論是在揮發(fā)性還是在極性方面，填充界面的分析物與吸附劑之間的相互作用會一定程度的影響重現(xiàn)性，從而影響化合物的回收率，甚至可能影響儲存期間的穩(wěn)定性。
固相微萃取是一種非常簡單有效的無溶劑樣品制備方法，可以把常規(guī)液-液萃取的所有步驟包括萃取、濃縮和轉(zhuǎn)移檢測都集成到一個設(shè)備中，從而大大簡化了樣品制備過程。它將涂覆的熔融石英纖維暴露于樣品的頂部空間，然后使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）和聚丙烯酸酯（PA）涂層材料作為吸附，樣品中的分析物被直接富集到纖維涂層中，最終與氣相色譜法聯(lián)用進(jìn)行VOCs的檢測[8]。
但無論是吸附柱也好，固相微萃取也好，都無可避免因為富集帶來的富集材料選擇、耗材成本高和吸附損耗問題。這會極大影響樣本檢測的重現(xiàn)性，從而影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。無需富集的高靈敏在線分析儀器則很好解決了這些難題，也是推向臨床應(yīng)用的一大重要因素。
可靠、標(biāo)準(zhǔn)化和高質(zhì)量的在線分析是臨床發(fā)展方向
目前科研最常用的是高靈敏GC–MS分析系統(tǒng)，結(jié)合預(yù)濃縮系統(tǒng)可以有效地離線收集、分離和鑒定人呼吸中大多數(shù)化合物，如脂族化合物、醇、醛、酮、胺及鹵代化合物，也足夠敏感去量化ppbv水平的VOCs。但GC-MS的耗時、昂貴、富集損耗、操作困難、無法實時檢測和重復(fù)標(biāo)準(zhǔn)化測量是臨床應(yīng)用的巨大阻力。
E-nose電子鼻利用納米傳感器陣列檢測呼出VOCs的復(fù)雜混合物的已知成分，具有小型化便攜、實時分析成本便宜的優(yōu)勢，但對于復(fù)雜疾病的研究和低濃度VOCs的精準(zhǔn)定量分析卻無能為力。
相比于GC-MS，質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)質(zhì)譜（PTR-MS）檢測VOC濃度可達(dá)pptv水平，可在線多次檢測且不需要費時昂貴的預(yù)濃縮步驟，目前已用于監(jiān)測麻醉、呼吸曲線和血液透析。但是對于VOCs分析而言也存在難檢測低碳烷烴類物質(zhì)及細(xì)菌代謝相關(guān)硫化物的局限。
大連化物所新開發(fā)的SPI-TOF利用復(fù)合電離技術(shù)能夠快速在線分析氣體中的痕量成分，其重復(fù)性好、碎片化程度低且無需預(yù)富集，具有成為VOCs標(biāo)準(zhǔn)分析工具的潛力。
表五 現(xiàn)有VOC檢測技術(shù)及性能對比

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來源：奇跡之光整理
商業(yè)化尚未成熟，機(jī)會眾多
不完全統(tǒng)計國際上呼氣相關(guān)的公司有9家，分布在各個國家，其中Owlstone是最有代表性的融資最多的企業(yè)，但離領(lǐng)軍地位還有一段距離。
商業(yè)化的檢測技術(shù)主要有質(zhì)譜（GC-MS、SIFT-MS、FAIMS、SESI-MS）和傳感器。大多數(shù)公司成立于2015年后，仍在做技術(shù)優(yōu)化和臨床驗證，整個行業(yè)處于早期發(fā)展階段，競爭并不激烈。產(chǎn)品管線多集中在肺部疾病、腫瘤、血糖和消化系統(tǒng)疾病。美國國家癌癥研究所提供200萬美元贈款資助Menssana Research多中心盲法研究，多家企業(yè)也連續(xù)拿到了融資，行業(yè)發(fā)展趨勢良好。
表六 商業(yè)化公司不完全統(tǒng)計

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來源：奇跡之光整理
呼氣檢測行業(yè)的轉(zhuǎn)折點已經(jīng)到來，產(chǎn)業(yè)爆發(fā)指日可待
從古代辨味識病到現(xiàn)在代謝組分析，一直朝著呼氣檢測的方向進(jìn)行突破。但是由于代謝組學(xué)的復(fù)雜性，呼氣檢測流程中樣本采集、樣本濃縮及分析流程沒有標(biāo)準(zhǔn)工具和流程優(yōu)化，導(dǎo)致產(chǎn)業(yè)化困難重重。所有的基礎(chǔ)研究都在探索不同的氣體采集方式，采用不用策略的樣本濃縮，并且需要處理吸附-解吸附的損耗和分離偏差的問題，最終學(xué)術(shù)上對于同一病種的VOCs標(biāo)志物組合沒有一個明確的定論。
隨著在線分析技術(shù)進(jìn)一步迭代升級，將無需樣本濃縮帶來的系統(tǒng)誤差。同時，高靈敏度分析儀器可以標(biāo)準(zhǔn)化高通量分析樣本。在疾病的篩查診斷上的標(biāo)志物會逐步形成共識，低成本操作簡便的非侵入式呼氣檢測正處于產(chǎn)業(yè)爆發(fā)的前夕。
【參考文獻(xiàn)】

[1]Francesco FD, Fuoco R etc.Breath analysis: Trends in techniques and clinical applications. Microchemical Journal. 2005;79:405–410.

[2]Souvik Das, Saurabh Pal, Madhuchhanda Mitra.Significance of Exhaled Breath Test in Clinical Diagnosis: A Special Focus on the Detection of Diabetes Mellitus. J Med Biol Eng. 2016; 36(5): 605–624.

[3]Hakim M, Broza YY, Barash O, et al. Volatile organic compounds of lung cancer and possible biochemical pathways. Chem Rev 2012; 112: 5949–5966.

[4]Hanna GB, Boshier PR, Markar SR, Romano A. Accuracy and Methodologic Challenges of Volatile Organic Compound–Based Exhaled Breath Tests for Cancer Diagnosis: A Systematic Review and Meta-analysis. JAMA Oncol. 2019;5(1):e182815. doi:10.1001/jamaoncol.2018.2815.

[5]Waqar M. Ahmed,Orcid etc.Exhaled Volatile Organic Compounds of Infection: A Systematic Review.ACS Infect. Dis. 2017, 3, 10, 695–710.

[6]Lieuwe D.J.Bos,PeterJ.Sterk.Volatile Metabolites of Pathogens: A Systematic Review.plospathogens. May 9, 2013.

[7] Exhaled breath analysis: a review of ‘breath-taking’ methods for off-line analysis；Oluwasola Lawal, Waqar M. Ahmed etc.Metabolomics. 2017; 13(10): 110. Published online.

[8]Solid-phase microextraction: a powerful sample preparation tool prior to mass spectrometric analysis.Vas G, Vékey K. Mass Spectrom. 2004 Mar; 39(3):233-54.

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關(guān)于藍(lán)色彩虹
藍(lán)色彩虹是由華大發(fā)起，服務(wù)于全球生命科學(xué)與精準(zhǔn)醫(yī)療初創(chuàng)公司的孵化與創(chuàng)投平臺，關(guān)注在DNA、RNA、蛋白、細(xì)胞、組織等多組學(xué)尺度上的前沿研究與技術(shù)，致力營造全要素支持的創(chuàng)新生態(tài)，提升產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)化效能。
關(guān)于BGI生命健康加速營
BGI生命健康加速營由藍(lán)色彩虹組織運營，是一個針對生命健康領(lǐng)域天使輪初創(chuàng)公司和創(chuàng)業(yè)團(tuán)隊打造的加速項目。每年定期全球招募創(chuàng)業(yè)項目，并在六個月營期內(nèi)，為入營團(tuán)隊提供種子資金、商業(yè)和技術(shù)指導(dǎo)、實驗室及儀器設(shè)備等資源和服務(wù)，加速團(tuán)隊成長。在營期結(jié)束后，持續(xù)為項目提供后續(xù)相關(guān)服務(wù)，包括投融資對接、潛在業(yè)務(wù)合作機(jī)會挖掘等。