隨著合成生物學(xué)與基因編輯技術(shù)的發(fā)展，在科學(xué)研究中需要編輯越來(lái)越多的基因，例如，為了構(gòu)建特定功能的菌株需要進(jìn)行多輪的基因編輯，而且需要通過(guò)不同基因編輯的組合構(gòu)建大量菌株進(jìn)行“試錯(cuò)”篩選。現(xiàn)有基因編輯方法需要引入特定篩選標(biāo)記或特定抗性的質(zhì)粒來(lái)完成基因編輯，這些篩選標(biāo)記或者質(zhì)粒需要在下一輪基因編輯前去除，從而實(shí)現(xiàn)無(wú)痕編輯或篩選標(biāo)記的重復(fù)利用。然而，篩選標(biāo)記或質(zhì)粒的去除效率很難達(dá)到100%（即會(huì)發(fā)生逃逸），因此在去除標(biāo)記后需要進(jìn)行單克隆的篩選和確認(rèn)。這增加了多輪基因編輯的周期，且需要更多的培養(yǎng)次數(shù)，增加了基因組自發(fā)突變的風(fēng)險(xiǎn)。

中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所研究員咸漠帶領(lǐng)的材料生物合成技術(shù)中心，基于“剪刀石頭布”策略實(shí)現(xiàn)免篩選標(biāo)記/質(zhì)粒消除步驟的多輪基因編輯方法，相關(guān)研究成果近日發(fā)表在Nucleic Acids Research上。研究構(gòu)建了三個(gè)能夠循環(huán)消除的基因編輯輔助質(zhì)粒（pRock，pPaper，pScissors），在按照“剪刀-石頭-布”順序分別使用這三個(gè)質(zhì)粒實(shí)施基因編輯時(shí)，可同時(shí)去除上一輪基因編輯中使用的輔助質(zhì)粒，從而免除了傳統(tǒng)方法中的篩選標(biāo)記或質(zhì)粒消除步驟，提高了多輪編輯的速度（圖1）。質(zhì)粒消除效率可達(dá)到99.99-100%，幾乎不會(huì)有逃逸情況。另外，該系統(tǒng)還存在雙重檢查機(jī)制：如上一輪發(fā)生了逃逸的情況，由于質(zhì)粒間的拮抗作用則不能進(jìn)行下一輪編輯。該研究在大腸桿菌和肺炎克雷伯氏菌中對(duì)該方法進(jìn)行了測(cè)試，快速完成了多輪的敲除、插入、替換等基因編輯操作。

利用本方法進(jìn)行連續(xù)多輪基因編輯時(shí)，每一輪編輯僅需要進(jìn)行兩次培養(yǎng)，即一次平板培養(yǎng)和一次單克隆液體培養(yǎng)（圖2），這幾乎是精細(xì)基因編輯所需要的最少培養(yǎng)次數(shù)。這不僅縮短了基因編輯周期，還減少了基因組隨機(jī)突變的可能性，這些優(yōu)勢(shì)在進(jìn)行大規(guī)模多輪基因編輯時(shí)尤為明顯。該方法是目前最快最魯棒的多輪基因編輯策略，可與現(xiàn)有其他CRISPR/Cas9編輯優(yōu)化策略進(jìn)行聯(lián)合使用，并且在未來(lái)更易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，同樣策略也可用于其他物種的基因編輯。

青島能源所博士后王紀(jì)超、碩士研究生隋新悅為論文的共同第一作者，研究員趙廣、咸漠為論文共同通訊作者。研究工作得到國(guó)家自然科學(xué)基金委員會(huì)、國(guó)家國(guó)防科技工業(yè)局等的資助。

該研究相關(guān)質(zhì)?？蓮牡谌介_(kāi)放獲?。篗olecularCloud（www.molecularcloud.org），MC_0101139、MC_0101140、MC_0101141，建議同時(shí)獲取MC_0000011及MC_0000012。

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　　圖1.基于“剪刀石頭布”策略的多基因編輯方法示意圖。A.三個(gè)能夠循環(huán)消除的基因編輯輔助質(zhì)粒，在實(shí)施基因編輯的同時(shí)能消除上一輪的質(zhì)粒。 B.相較于傳統(tǒng)方法，本方法不需要單獨(dú)的篩選標(biāo)記或質(zhì)粒消除步驟

圖2.基于“剪刀石頭布”策略的多輪基因編輯流程圖。A.“剪刀石頭布”基因編輯輔助質(zhì)粒構(gòu)建流程圖。B.連續(xù)多輪基因編輯步驟流程圖

來(lái)源： 青島生物能源與過(guò)程研究所