北京時間2021年1月15日，顏寧與清華大學(xué)結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心閆創(chuàng)業(yè)研究組、西湖大學(xué)鄢仁鴻博士等合作在《科學(xué)》（Science）雜志在線發(fā)表了題為“A structure of human Scap bound to Insig-2 suggests how their?interaction is regulated by sterols”（“甾醇調(diào)控人源Scap和Insig-2相互作用的結(jié)構(gòu)機理）的研究長文，揭示了膽固醇代謝調(diào)控通路中長久以來的關(guān)鍵問題：細胞如何通過有效感知自身的膽固醇水平來激活或者抑制膽固醇的合成與吸收，以維持細胞內(nèi)的膽固醇穩(wěn)態(tài)。

心血管疾病是威脅人類健康的主要殺手之一。據(jù)統(tǒng)計，中國每年死亡總?cè)藬?shù)中約有40%是由于心腦血管疾病導(dǎo)致的，而心腦血管疾病的發(fā)生與膽固醇代謝異常密切相關(guān)。膽固醇是一種脂質(zhì)小分子，是哺乳動物細胞膜的重要組成成分，主要調(diào)控細胞膜的流動性，也是膽酸、維生素D以及一些荷爾蒙合成的前體分子，同時還作為信號分子參與細胞內(nèi)多個重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。當(dāng)人體內(nèi)膽固醇代謝異常，過量的膽固醇積累在血管中會促進動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展，最終可能引發(fā)冠心病、中風(fēng)等心腦血管疾病。

過去近30年，美國西南醫(yī)學(xué)中心的兩位諾貝爾生理與醫(yī)學(xué)獎得主Joseph Goldstein和Michael Brown領(lǐng)導(dǎo)的研究組通過一系列生化和細胞實驗發(fā)現(xiàn)了膽固醇代謝的負反饋調(diào)控機制，即SREBP（Sterol Regulatory Element-Binding Protein）信號通路，來調(diào)控細胞水平的膽固醇攝取和合成，從而維持細胞內(nèi)膽固醇含量的穩(wěn)態(tài)。

顏寧、閆創(chuàng)業(yè)、鄢仁鴻等在《科學(xué)》報道膽固醇代謝關(guān)鍵調(diào)控復(fù)合物Scap-Insig2的結(jié)構(gòu)與工作機理-肽度TIMEDOO
圖一 SREBP信號通路示意圖
在SREBP通路中，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的膜蛋白SREBP2是轉(zhuǎn)錄因子前體蛋白。SREBP2和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的另一個膜蛋白Scap（SREBP cleavage-activating protein）形成復(fù)合物。當(dāng)細胞內(nèi)膽固醇含量較高時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的Insig蛋白能夠通過跨膜區(qū)與Scap蛋白的甾醇感受結(jié)構(gòu)域（Sterol sensing domain，SSD）相互作用，將SREBP2-Scap復(fù)合物錨定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，從而降低細胞內(nèi)膽固醇的吸收和合成。而當(dāng)細胞內(nèi)膽固醇含量降低時，Scap無法繼續(xù)與Insig相互作用，于是SREBP2-Scap復(fù)合物被運送到高爾基體上，SREBP2在此被S1P和S2P蛋白酶相繼切割，釋放出N端轉(zhuǎn)錄因子進入細胞核中，激活膽固醇攝取和合成基因的表達。

盡管對于SREBP信號通路的細胞生物學(xué)與生物化學(xué)特征有了很多的研究，但受限于相關(guān)膜蛋白在表達純化結(jié)構(gòu)解析等方面的技術(shù)難度，這個領(lǐng)域的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究進展一直很緩慢。這里面最關(guān)鍵的一個問題就是Scap和Insig蛋白的相互作用是如何被25HC等甾醇類分子調(diào)控的。

這道科學(xué)難題被顏寧教授戲稱為自己“初戀課題”：2001年她加入施一公教授在普林斯頓大學(xué)分子生物學(xué)系的實驗室讀博的第一個課題便是針對SREBP通路的結(jié)構(gòu)生物學(xué)與生物化學(xué)研究；2005年做博士后的第一個課題便是SREBP通路中的膜蛋白們；在清華獨立領(lǐng)導(dǎo)實驗室之后的第一個科技部973項目也是針對SREBP通路的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究。過去幾年，顏寧實驗室先后解析了Insig的細菌同源蛋白MvINS的晶體結(jié)構(gòu)（2015）， Scap在裂殖酵母中的同源蛋白Scp1的C端結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)（2015）及Scp1-Sre1復(fù)合物的低分辨電鏡結(jié)構(gòu)（2016）；為了理解SSD感受甾醇的機理，她的課題組系統(tǒng)研究了兩個含有SSD的蛋白NPC1（2016，2020）和Patched 1（2018, 2019）的工作機理。盡管這些前期成果很重要，但依然無法解釋Scap和Insig如何感知內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜內(nèi)的膽固醇水平。要解答這個問題，必須獲得Scap-Insig結(jié)合25HC的高分辨率結(jié)構(gòu)。

顏寧課題組歷經(jīng)幾代博士生、博士后的努力，從獲得性質(zhì)穩(wěn)定、均一化程度較高的復(fù)合物到結(jié)構(gòu)解析，可謂是經(jīng)歷了“九九八十一難”。這個分子量小、結(jié)構(gòu)域靈活的膜蛋白復(fù)合物，即便到了冷凍電鏡時代，依舊是硬骨頭，很長一段時間，分辨率止步于五六埃，無法看到精細的結(jié)構(gòu)。為了解決這個難題，顏寧與專攻小分子膜蛋白電鏡結(jié)構(gòu)解析的清華大學(xué)生命學(xué)院、結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖中心研究員閆創(chuàng)業(yè)博士合作，后者通過對算法的不斷創(chuàng)新和改進，終于將跨膜區(qū)的分辨率提高到了4埃以內(nèi)！在獲得蛋白復(fù)合物的近原子分辨率結(jié)構(gòu)之后，研究組的成員們又通過大量生物化學(xué)和細胞生物學(xué)的實驗手段，與結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)相互印證，解釋了Scap和Insig蛋白依賴于25HC相互作用的一個復(fù)雜的調(diào)控機理。

這篇文章主要報道了以下成果

1.?獲得了人源Scap與Insig-2蛋白復(fù)合物的電鏡結(jié)構(gòu)，跨膜區(qū)平均分辨率3.7 ?，而Scap和Insig-2的界面則達到3.3 ?，可以觀測相互作用細節(jié)；

2.?在Scap和Insig-2之間清晰看到了25HC分子，顛覆了之前對于25HC結(jié)合位點和調(diào)控機理的認知，并且解釋了為何多一個親水基團的25HC比高度疏水的膽固醇更有效地促進這兩個蛋白的相互作用；

3.?與其它含有SSD的如NPC1、Patched 1等蛋白相比，Scap的SSD有復(fù)雜的構(gòu)象變化：它的第四段跨膜螺旋S4從中間斷開，分成了S4a和S4b兩段，其中S4a向結(jié)構(gòu)域內(nèi)部彎折，從而提供了25HC結(jié)合所需要的空間，同時彎折區(qū)對于直接結(jié)合Insig以及兼容Scap上與Insig主要相互作用的S2新型構(gòu)象至關(guān)重要。生化實驗也進一步驗證了這個斷裂的跨膜區(qū)對于形成復(fù)合物的重要作用，從而解釋了為何兩個蛋白的相互作用需要25HC等甾醇分子，因為在疏水的跨膜區(qū)內(nèi)維持暴露親水基團的斷裂螺旋結(jié)構(gòu)需要外界因素來穩(wěn)定，比如25HC的結(jié)合。根據(jù)這些結(jié)構(gòu)分析，作者為此前的兩個經(jīng)典Scap突變，不需要25HC既可以結(jié)合Insig的D428A以及徹底喪失Insig結(jié)合能力的Y298C，提供了結(jié)構(gòu)解釋，并據(jù)此預(yù)測了Q432A可能會與D428A具有相似的效果，這一分析果然在生化實驗中得到證實。

顏寧、閆創(chuàng)業(yè)、鄢仁鴻等在《科學(xué)》報道膽固醇代謝關(guān)鍵調(diào)控復(fù)合物Scap-Insig2的結(jié)構(gòu)與工作機理-肽度TIMEDOO
圖二 Scap-Insig2復(fù)合物結(jié)構(gòu)示意圖
最后，作者們指出盡管這個研究對于理解SREBP通路感知細胞內(nèi)甾醇水平具有至關(guān)重要的作用，但后續(xù)還有很多問題有待進一步研究和解答。比如由于該結(jié)構(gòu)只解析了跨膜區(qū)的結(jié)構(gòu)，因此無法解釋Scap蛋白可溶區(qū)受膽固醇、而非25HC等衍生分子調(diào)控的機理；再比如，作者推測Scap蛋白自身在跨膜區(qū)內(nèi)不會穩(wěn)定，在沒有Insig時也許需要通過寡聚化來保持穩(wěn)定，這些有待于通過獲得Scap本身的結(jié)構(gòu)來予以解答。

顏寧、清華大學(xué)結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心閆創(chuàng)業(yè)為論文共同通訊作者，西湖大學(xué)博士后鄢仁鴻、清華大學(xué)博士生曹平平、宋聞麒為本文的共同第一作者。冷凍電鏡數(shù)據(jù)分別在國家蛋白質(zhì)科學(xué)中心（北京）清華大學(xué)冷凍電鏡平臺和西湖大學(xué)冷凍電鏡平臺收集，清華大學(xué)高性能計算平臺和西湖大學(xué)超算中心分別為本研究的數(shù)據(jù)處理提供了支持。

原文鏈接
https://science.sciencemag.org/content/early/2021/01/13/science.abb2224?rss=1
主要參考文獻
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3.?X. Gong et al., Complex structure of the fission yeast SREBP-SCAP binding domains reveals an oligomeric organization. Cell Res 26, 1197-1211 (2016).

4.?X. Gong et al., Structural Insights into the Niemann-Pick C1 (NPC1)-Mediated?Cholesterol Transfer and Ebola Infection. Cell 165, 1467-1478 (2016).

5.?H. W. Qian et al., Structural Basis of Low-pH-Dependent Lysosomal Cholesterol Egress by NPC1 and NPC2. Cell 182, 98-111?(2020).

6.?X. Gong et al., Structural basis for the recognition of Sonic Hedgehog by human Patched1. Science 361, eaas8935 (2018).

7.?H. W. Qian et al., Inhibition of tetrameric Patched1 by Sonic Hedgehog through an asymmetric paradigm. Nat Commun 10, 2320 (2019).

來源：結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心