自新冠病毒肆虐以來，關(guān)于康復(fù)者二次感染、復(fù)陽 的案例屢見不鮮。此前醫(yī)學(xué)專家普遍認(rèn)為造成復(fù)陽的原因是人體免疫系統(tǒng)無法抵御冠狀病毒的持續(xù)攻擊。近日，MIT 分子生物學(xué)家 Rudolf Jaenisch 團(tuán)隊的一項研究揭示了另外一種可能。

該研究指出，SARS-CoV-2 RNA 可以逆轉(zhuǎn)錄并整合到人類基因組中。簡單理解，就是病毒并沒有在人體內(nèi)消失，而是通過逆轉(zhuǎn)錄與人體 DNA 結(jié)合進(jìn)行了隱藏，這可能是造成患者復(fù)陽的原因。

圖 | 論文 “SARS-CoV-2 RNA reverse-transcribed and integrated into the human genome” （來源：bioRxiv）

目前，該研究論文發(fā)表在了預(yù)印平臺 bioRxiv 上，一經(jīng)上線就引發(fā)了業(yè)內(nèi)激烈討論。值得注意的是，對此研究的評論呈現(xiàn)出兩種截然相反的態(tài)勢，有專家認(rèn)為這是一項 “頗具啟發(fā)性的研究”，但也有觀點質(zhì)疑 “這項研究是否具有生物學(xué)意義”。

香港大學(xué)病毒學(xué)專家金冬雁教授就認(rèn)為，這項實驗是 “站不住腳” 的。按照實驗的推論，如果 RNA 病毒可以通過逆轉(zhuǎn)錄整合進(jìn)入人體 DNA，那么通過常見的流感就可能改變?nèi)梭w的基因。但實際上，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)還從未發(fā)現(xiàn)過流感病毒基因整合到人類基因組的痕跡。

SARS-CoV-2 RNA 可以逆轉(zhuǎn)錄并整合到人類基因組

起初，Jaenisch 團(tuán)隊是對感染新冠的患者初次痊愈后數(shù)周或數(shù)月核酸檢測復(fù)陽的結(jié)果感到好奇。盡管有報道稱復(fù)陽的原因是再次感染病毒造成的，但對痊愈者進(jìn)行嚴(yán)格隔離措施后，仍然能夠從他們身上獲取到病毒信息，并且這些病毒并不具備復(fù)制屬性和傳染屬性。

作為正鏈 RNA 病毒，SARS-CoV-2 和 SARS-CoV-1、MERS 等乙型冠狀病毒一樣，利用 RNA 聚合酶來復(fù)制基因組 RNA 及轉(zhuǎn)錄亞基因組 RNA。但從康復(fù)者的檢測樣本中未發(fā)現(xiàn)病毒的復(fù)制屬性，研究人員由此推斷出一種可能，SARS-CoV-2 RNA 逆轉(zhuǎn)錄并整合到人類基因組中，整合的 DNA 拷貝的轉(zhuǎn)錄可能導(dǎo)致 PCR 陽性的結(jié)果。

為證實上述推論，該團(tuán)隊通過體外細(xì)胞實驗，利用新冠病毒和人體 LINE-1 逆轉(zhuǎn)錄酶或 HIV-1 逆轉(zhuǎn)錄酶，獲得了三個發(fā)現(xiàn)：

感染培養(yǎng)細(xì)胞和（復(fù)陽）患者細(xì)胞中的嵌合轉(zhuǎn)錄物表達(dá)與病毒序列的基因組整合一致；

為了研究病毒轉(zhuǎn)錄、整合到人類細(xì)胞核中基因組的可能性，研究人員分析了 SARS-CoV-2 感染細(xì)胞的 RNA-Seq（轉(zhuǎn)錄測序）數(shù)據(jù)。通過對來自新冠確診患者肺部、心臟、大腦、胃部及 BALF（支氣管細(xì)胞灌洗液）等細(xì)胞樣本的轉(zhuǎn)錄測序數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)大量樣本細(xì)胞中都可能存在人體基因組及病毒基因的嵌合序列。

這些組合序列一般占總樣本的 0.004% – 0.14%，其中來自重癥新冠患者 BALF（支氣管細(xì)胞灌洗液）細(xì)胞的組合序列高達(dá) 69.24%。

并且大部分嵌合序列 RNA 都來自 SARS-CoV-2 的核衣殼（N）序列。而核衣殼 (N) 是 SARSCoV-2 亞基因組 RNA 中含量最高的 RNA，因此最有可能成為逆轉(zhuǎn)錄和整合的靶點。研究人員認(rèn)為，這些分析支持了 SARS-CoV-2 RNA 可能會逆轉(zhuǎn)錄整合到感染細(xì)胞的基因組中，并產(chǎn)生嵌合病毒 – 細(xì)胞轉(zhuǎn)錄物。

SARS-CoV-2 RNA 可以在過表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄酶的細(xì)胞中逆轉(zhuǎn)錄并整合到人類基因組中；

為了進(jìn)一步印證 SARS-CoV-2 RNA 逆轉(zhuǎn)錄和整合，研究人員在 HEK293T 細(xì)胞中過表達(dá)人體 LINE-1 或 HIV-1 逆轉(zhuǎn)錄酶，并用 SARS-CoV-2 感染轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。

考慮到核衣殼（N）RNA 是最有可能實現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄整合的靶點，研究人員選擇了 4 套核衣殼（N）靶向 PCR 引物對純化的細(xì)胞 DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，并對細(xì)胞基因組 DNA 進(jìn)行了凝膠電泳分析。研究人員不僅確認(rèn)了核衣殼（N）序列，還從 CMV-LINE-1 過表達(dá)細(xì)胞的基因組 DNA （gDNA）中克隆出了全長核衣殼（N）DNA，并通過 Sanger 測序確認(rèn)了其序列。

在感染的 2 天后，用 PCR 或熒光原位雜交檢測細(xì)胞的病毒序列。結(jié)果證實，在同一組過表達(dá) LINE-1 的感染細(xì)胞中，核衣殼（N）的信號比例（約 35%）明顯高于未過表達(dá) LINE-1 的感染細(xì)胞（約 12%）。轉(zhuǎn)染 LINE-1 的感染細(xì)胞（約 80% 的轉(zhuǎn)染效率）出現(xiàn)核衣殼（N）信號陽性的比例（約 30%）明顯高于未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞（13%）。感染但未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞也表現(xiàn)出核衣殼（N）信號，盡管頻率較低（約 10%）。

以上實驗進(jìn)一步證實，SARS-CoV-2 RNA 可以在體外被過表達(dá)的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄。

SARS-CoV-2 RNA 和細(xì)胞能夠誘導(dǎo)人體 LINE-1 表達(dá)，與逆轉(zhuǎn)錄整合相關(guān)；

人體內(nèi)的 LINE-1 不僅是自主逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，也有助于非自主元件的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子?；?LINE-1 的這一特殊性，研究人員發(fā)現(xiàn)，當(dāng)感染 SARS-CoV-2 時 LINE-1 在 Calu3 細(xì)胞中的表達(dá)量上調(diào)了約 3-4 倍。此外，對 Calu3 細(xì)胞 DNA 的 PCR 分析顯示，感染后 SARS-CoV-2 N 序列的逆轉(zhuǎn)錄整合，可能來自細(xì)胞因子激活的 LINE-1 逆轉(zhuǎn)錄酶。

圖 | 在 SARS-CoV-2 感染和含細(xì)胞因子的條件培養(yǎng)基處理下，細(xì)胞系 1 作為內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄酶源在人類細(xì)胞中表達(dá)

雖然 LINE-1 在人體內(nèi)基因組的占比達(dá)到 17%，但實際上其活性較低，50 萬份拷貝中僅有 100 份處于活躍狀態(tài)。為了研究細(xì)胞因子是否能夠單獨誘導(dǎo) LINE-1，研究人員用含有細(xì)胞因子的培養(yǎng)基來培養(yǎng)骨髓細(xì)胞、小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、CART 細(xì)胞，通過 PCR 分析發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性 LINE-1 表達(dá)上調(diào)了 2-3 倍。

研究人員還指出，LINE-1 表達(dá)在 SARS-CoV-2 感染后的細(xì)胞 RNA-Seq 數(shù)據(jù)中顯著上調(diào)，與嵌合序列的豐度相關(guān)。也就是說，通過逆轉(zhuǎn)錄整合進(jìn)入人基因組的新冠病毒序列可能是亞基因組片段，因為整合序列大多集中在核衣殼（N）附近，因此也不具備感染性。

Jaenisch 團(tuán)隊表示，實驗證實了 SARS-CoV-2 RNA 可以通過逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄并整合到人類基因組中；并且 LINE-1 的表達(dá)可在 SARS-CoV-2 感染或暴露于細(xì)胞因子后被誘導(dǎo)，表明了 SARS-CoV-2 在患者體內(nèi)逆轉(zhuǎn)整合的分子機(jī)制；整合的片段最有可能是 SARS-CoV-2 亞基因組片段。SARS-CoV-2 RNA 逆轉(zhuǎn)錄解釋了病毒暴露后，在沒有檢測到傳染性病毒的情況下，為何病毒序列仍然存在。

研究引發(fā)熱議，真實體內(nèi)情況不支持實驗結(jié)論

研究人員總結(jié)認(rèn)為，如果 LINE-1 序列在人體細(xì)胞中自然產(chǎn)生 RT（逆轉(zhuǎn)錄酶），那么確診感染新冠的患者身體里可能已經(jīng)發(fā)生了病毒與 DNA 結(jié)合的情況。除此之外，對于同時感染了新冠和艾滋的患者來說，體內(nèi)可能也已經(jīng)發(fā)生了這種整合變化。

該實驗為核酸檢測不到患者體內(nèi)病毒的殘留提供了一種可能性的分析。與此同時，也對目前依靠 PCR 檢測新冠及治療方法有效性提出了一些擔(dān)憂。

“目前僅發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄病毒以及與之類似的乙型肝炎病毒能夠把核酸整合到宿主 DNA 中。逆轉(zhuǎn)錄病毒必須通過整合才能不斷復(fù)制并組裝新的病毒，但新冠病毒并不是逆轉(zhuǎn)錄病毒。在 MIT 的這項實驗中，從細(xì)胞外人為地加入過量的逆轉(zhuǎn)錄酶，才導(dǎo)致 RNA 逆轉(zhuǎn)錄成為 DNA 的結(jié)果。但實際上，人體細(xì)胞中并沒有這么多的逆轉(zhuǎn)錄酶，所以這個實驗更偏向一種‘假說’，與人體細(xì)胞內(nèi)的真實環(huán)境與可能出現(xiàn)的實際情況有很大出入。” 金冬雁教授告訴 DeepTech。

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院研究員、原北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院教授王晨光也指出，新冠病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒在感染宿主后的行為有本質(zhì)的區(qū)別。逆轉(zhuǎn)錄病毒相當(dāng)于病毒劫持了宿主，并把自己變成了宿主身體內(nèi)的一份子。而新冠病毒在感染宿主細(xì)胞后，不像逆轉(zhuǎn)錄病毒那樣 “反客為主”，病毒核酸在宿主細(xì)胞中只能進(jìn)行復(fù)制和蛋白質(zhì)得以表達(dá)產(chǎn)生，最終完成病毒顆粒的組裝。

大家熟知的典型逆轉(zhuǎn)錄病毒還有 HIV，它可以通過自身 RNA 產(chǎn)生酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄變成 DNA，再通過不斷復(fù)制融合進(jìn)入人體的基因組。而新冠病毒是通過 RNA 聚合酶完成復(fù)制，中間不會有逆轉(zhuǎn)錄到 DNA 的過程。此外，新冠病毒的復(fù)制過程都是在細(xì)胞質(zhì)里完成的，而 DNA 主要集中在細(xì)胞核之中，所以新冠病毒的復(fù)制過程并不會觸碰到 DNA。

實際上，在人類進(jìn)化過程中，已經(jīng)有大量的病毒或細(xì)菌 RNA 整合進(jìn)入人體 DNA，但大多數(shù)的整合基因組都被證實是沒有任何功效的。

盡管質(zhì)疑聲不斷，也有部分專家學(xué)者對該實驗給予了肯定。《科學(xué)》雜志援引美國著名病毒學(xué)家、艾滋病毒發(fā)現(xiàn)者 Robert Gallo 評論稱，雖然對實驗的完整性持懷疑態(tài)度，但我非常喜歡這項研究，我猜實驗是正確的。

值得注意的是，針對該實驗及衍生的疫苗討論正不斷升級。有學(xué)者指出 “病毒 RNA 可以逆轉(zhuǎn)錄整合進(jìn)入人體 DNA，那基于蛋白合成的 mRNA 疫苗也可以通過逆轉(zhuǎn)錄整合進(jìn)入人體 DNA，這將導(dǎo)致注射疫苗后的人類基因被改變。”

金冬雁向 DeepTech 解釋了 mRNA 的特性，首先 mRNA 壽命很短暫，從幾十分鐘到幾小時不等。而且 mRNA 在體內(nèi)體外都很容易碰到 RNA 酶而被降解，哪怕人體的汗液、眼淚和唾液都有 RNA 酶。所以 mRNA 疫苗要放在零下 70°C 才能保存其活性。其次 mRNA 進(jìn)入的細(xì)胞也是有壽命的，會自然死亡。針對新冠病毒抗原的抗體和免疫細(xì)胞形成后，也會幫助人體徹底清除帶有 mRNA 疫苗的細(xì)胞，所以這些細(xì)胞不可能一直停留在身體內(nèi)，根本不會導(dǎo)致所謂的疫苗逆轉(zhuǎn)錄為 DNA 造成基因改變。

王晨光也指出，mRNA 核酸疫苗僅僅包含病毒的一個編碼蛋白的核酸序列，其病毒核酸物質(zhì)既不能被整合到人體基因組 DNA，也不能在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制擴(kuò)增。細(xì)胞不僅沒有被劫持，反而利用 mRNA 合成的蛋白質(zhì)裝備了一只武器精良的雇傭軍來防范新冠病毒。

雖然整個實驗過程缺乏直接性證據(jù)證明新冠患者體內(nèi)的病毒整合進(jìn)入了 DNA，這也是很多學(xué)者詬病此項研究的主要原因，但這種假設(shè)確實為病毒研究提供了一定的價值，尤其是為未來防范、規(guī)避 RNA 病毒風(fēng)險的時候。不放過每一種可能，大概就是生物學(xué)最大的魅力。

澳大利亞國立大學(xué)約翰柯廷醫(yī)學(xué)研究院，遺傳與表觀遺傳方向博士生張旌對本文亦有貢獻(xiàn)

來源：麻省理工科技評論