北京時間2月26日，Science以Research Article形式在線發(fā)表了中國科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心（生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所）研究員周斌研究組的研究成果Proliferation tracing reveals regional hepatocyte generation in liver homeostasis and repair。該研究首次開發(fā)出能夠長時程示蹤體內(nèi)細(xì)胞增殖的新技術(shù)，利用該技術(shù)研究人員發(fā)現(xiàn)了成體肝細(xì)胞的來源，為肝臟再生及疾病臨床治療研究提供了新思路。

　　細(xì)胞增殖是多細(xì)胞生物體在發(fā)育、生理穩(wěn)態(tài)和組織再生中的基本生物學(xué)過程，細(xì)胞增殖過多或受阻是較多疾病的致病基礎(chǔ)。檢測細(xì)胞的增殖能力對于發(fā)育生物學(xué)、腫瘤學(xué)、神經(jīng)科學(xué)和再生醫(yī)學(xué)等學(xué)科的研究十分重要。目前，檢測細(xì)胞增殖的方法主要有兩種：基于細(xì)胞增殖標(biāo)記物（如Ki67、pH-H3等）的組織化學(xué)染色；核苷酸類似物（如BrdU、EdU等）的摻入。然而，上述檢測方法均存在一定的局限性：在時間上，檢測的是某個時間點而非某個時間段內(nèi)的細(xì)胞增殖，就像照相機，只能拍攝某一瞬間的細(xì)胞增殖信號，這對于一些增殖能力較低的細(xì)胞如心肌細(xì)胞、神經(jīng)元等較難檢測到；在空間上，所有類型的增殖細(xì)胞都會被無差別的檢測，容易造成非目的細(xì)胞增殖信號的干擾，信噪比低、分辨率差。因此，開發(fā)一種有效檢測體內(nèi)細(xì)胞增殖的新技術(shù)，實現(xiàn)長時間不間斷、組織特異性地標(biāo)記細(xì)胞增殖尤為重要。

　　周斌研究組長期致力于新型遺傳譜系示蹤技術(shù)的開發(fā)與應(yīng)用。研究中，科研人員建立了一種檢測細(xì)胞增殖的新技術(shù)——ProTracer（Proliferation Tracer）。作為一種遺傳學(xué)技術(shù)，ProTracer突破了傳統(tǒng)檢測細(xì)胞增殖方法的思維模式，利用廣泛使用的細(xì)胞增殖標(biāo)記物Ki67，在課題組前期開發(fā)的Dre-rox和Cre-loxP的雙同源重組酶介導(dǎo)的遺傳譜系示蹤技術(shù)的（He et al., Nature Medicine 2017）基礎(chǔ)上，利用Dre-rox啟動Cre同源重酶介導(dǎo)的細(xì)胞增殖示蹤系統(tǒng)進(jìn)行遺傳標(biāo)記。ProTracer猶如一臺錄像機，一旦啟動便可實現(xiàn)在數(shù)月甚至數(shù)年內(nèi)不間斷地記錄細(xì)胞增殖，這對于檢測增殖能力較低的細(xì)胞以及評估細(xì)胞增殖能力的動態(tài)變化過程十分有益。同時，ProTracer可以實現(xiàn)直接檢測某一特定譜系細(xì)胞增殖情況，避免其他類型細(xì)胞增殖信號的干擾，提高了信噪比和分辨率，使檢測信號更直觀，能夠?qū)崿F(xiàn)從器官整體水平上觀察細(xì)胞增殖。此外，ProTracer能夠?qū)崿F(xiàn)活體檢測細(xì)胞增殖，可以在不犧牲動物的情況下，直接在同一個動物上多時間點檢測體內(nèi)細(xì)胞增殖，觀察細(xì)胞增殖的動態(tài)變化過程。ProTracer可廣泛應(yīng)用于不同組織器官細(xì)胞增殖的檢測，為發(fā)育生物學(xué)、腫瘤學(xué)、神經(jīng)科學(xué)和再生醫(yī)學(xué)等研究領(lǐng)域提供技術(shù)支撐。

　　周斌研究組利用ProTracer研究了在成體肝臟生理穩(wěn)態(tài)和損傷再生過程中肝細(xì)胞的來源。目前，在肝臟領(lǐng)域，這是一個亟待解決且具有爭議的重要科學(xué)問題。盡管在某些極其嚴(yán)重的肝損傷情況下，膽管細(xì)胞可以轉(zhuǎn)分化貢獻(xiàn)形成肝細(xì)胞，但在肝臟生理穩(wěn)態(tài)和損傷再生過程中的肝細(xì)胞的更新主要依賴原有肝細(xì)胞的自我增殖。肝臟的基本結(jié)構(gòu)單位是肝小葉，肝小葉中的肝細(xì)胞由于代謝功能和基因表達(dá)等的不同具有較大的異質(zhì)性，從肝門靜脈區(qū)到肝中央靜脈區(qū)大體可分為三區(qū)：門靜脈周圍肝細(xì)胞（E-CAD⁺，Zone 1）、中間區(qū)肝細(xì)胞（E-CAD^–GS^–，Zone 2）和中央靜脈周圍肝細(xì)胞（GS⁺，Zone 3）。 有研究認(rèn)為，不同區(qū)域的肝細(xì)胞增殖能力顯著不同，但究竟哪些肝細(xì)胞亞群對新生肝細(xì)胞起主要貢獻(xiàn)仍存在較大爭議，目前主要有以下幾種理論：肝細(xì)胞流動理論（肝細(xì)胞由門靜脈側(cè)向中央靜脈側(cè)流動，Liver 1985）；中央靜脈周圍肝細(xì)胞理論（Axin2⁺肝細(xì)胞，Nature 2015）；門靜脈周圍肝細(xì)胞理論（Sox9⁺肝細(xì)胞，Cell 2015）；分散式理論（Tert^high肝細(xì)胞，Nature 2018）；廣泛分布式理論（肝細(xì)胞無差別增殖，Cell Stem Cell 2020）。以往研究均是依賴單個分子標(biāo)記分析肝臟中某一肝細(xì)胞亞群的擴增能力，缺少對肝臟整體水平上對所有肝細(xì)胞增殖能力的分析。

　　周斌研究組突破此前的研究模式，即不再依賴單一分子標(biāo)記追蹤某一肝細(xì)胞亞群的擴增情況，而是利用ProTracer技術(shù)去直接標(biāo)記新生的肝細(xì)胞，不僅可以實現(xiàn)對所有肝細(xì)胞類群進(jìn)行分析，而且可以直觀精準(zhǔn)地展現(xiàn)出新生肝細(xì)胞的來源。研究人員采用廣譜性的ProTracer（所有類型細(xì)胞的增殖都能夠被檢測）在成體啟動細(xì)胞增殖的記錄，并在啟動后的多個不同時間點檢測肝細(xì)胞的增殖信號，結(jié)合E-CAD和GS等肝細(xì)胞分區(qū)標(biāo)記基因免疫熒光共染色，發(fā)現(xiàn)在生理穩(wěn)態(tài)過程中肝細(xì)胞通過緩慢的增殖維持自我更新。新生的肝細(xì)胞并非來源于以往報道的任何一個類群，而是主要來源于肝小葉中的中間區(qū)域（E-CAD^–GS^–，Zone 2）。

　　為了排除非肝細(xì)胞增殖信號的干擾，研究人員在廣譜性ProTracer技術(shù)的基礎(chǔ)上，結(jié)合肝細(xì)胞特異性表達(dá)的基因Albumin（Alb）啟動子，開發(fā)了肝細(xì)胞特異性的ProTracer技術(shù)。肝細(xì)胞特異性的ProTracer僅標(biāo)記肝細(xì)胞的增殖，能夠?qū)崿F(xiàn)直接在肝臟器官整體水平上展現(xiàn)肝細(xì)胞增殖。

　　將肝細(xì)胞特異性ProTracer在成體啟動后，研究人員將肝臟的全標(biāo)本進(jìn)行了熒光拍照，發(fā)現(xiàn)被tdTomato紅色熒光標(biāo)記的增殖的肝細(xì)胞呈現(xiàn)出一圈圈類似“甜甜圈”的形狀（圖A），說明肝細(xì)胞增殖具有區(qū)域偏好性，肝臟組織切片的免疫熒光染色結(jié)果進(jìn)一步證實了增殖的肝細(xì)胞位于肝小葉的中間區(qū)域，即E-CAD^–GS^–的Zone 2（圖B）。此外，周斌組還開發(fā)了活體檢測肝細(xì)胞增殖的ProTracer技術(shù)，利用該技術(shù)研究人員檢測了同一個小鼠個體在多個不同時間點肝細(xì)胞的增殖及其動態(tài)變化過程，這也是首次實現(xiàn)活體檢測細(xì)胞增殖。

　　為了研究肝臟損傷再生過程中新生肝細(xì)胞的來源，研究人員利用ProTracer技術(shù)結(jié)合肝切、膽管結(jié)扎和CCl₄等多種肝損傷模型，發(fā)現(xiàn)在肝切模型中，位于Zone 1的肝細(xì)胞起始肝臟再生過程，而后Zone 2的肝細(xì)胞迅速增殖。而在膽管結(jié)扎和CCl₄急性損傷模型中，則是位于Zone 2的肝細(xì)胞起始肝臟再生過程。此外，研究人員利用廣譜性ProTracer系統(tǒng)地描繪了肝臟再生過程中其他類型細(xì)胞的增殖情況，如膽管上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞。

　　綜上，該研究開發(fā)出一種檢測細(xì)胞增殖的遺傳新技術(shù)——ProTracer，以全新的視角探究了成體肝細(xì)胞的來源，突破了傳統(tǒng)思維模式和技術(shù)局限性，直觀地展現(xiàn)了所有肝細(xì)胞類群的增殖情況，首次發(fā)現(xiàn)肝小葉中間區(qū)域（Zone 2）的肝細(xì)胞是成體肝臟在生理穩(wěn)態(tài)中新生肝細(xì)胞的主要細(xì)胞來源，并揭示了不同損傷再生模型中新生肝細(xì)胞的來源，準(zhǔn)確回答了成體肝細(xì)胞來源這一重要科學(xué)問題。該研究為肝臟損傷修復(fù)再生研究開辟了新思路，為肝臟疾病的治療提供了新的理論基礎(chǔ)。

　　此外，新開發(fā)的ProTracer技術(shù)具有長時間不間斷檢測細(xì)胞增殖的能力，可以特異性地標(biāo)記某種特定細(xì)胞譜系的細(xì)胞增殖，并實現(xiàn)了不犧牲樣品直接活體檢測細(xì)胞增殖，從多個維度刷新了細(xì)胞增殖檢測的能力和范圍，可以廣泛應(yīng)用于不同組織器官細(xì)胞增殖的檢測，為發(fā)育生物學(xué)、腫瘤學(xué)、神經(jīng)科學(xué)和再生醫(yī)學(xué)等研究領(lǐng)域提供技術(shù)支撐。

　　周斌研究組副研究員何靈娟、博士后蒲文娟、博士研究生劉秀秀為論文的共同第一作者，周斌為論文通訊作者。研究工作得到瑞士諾華醫(yī)學(xué)生物研究所教授Jan S. Tchorz、南京醫(yī)科大學(xué)教授季勇、瑞典阿斯利康制藥有限公司博士Qing-Dong Wang和上海南方模式生物公司博士孫瑞林及其團(tuán)隊的支持。該工作受到分子細(xì)胞卓越中心動物平臺和細(xì)胞分析技術(shù)平臺的支持，并獲得中科院、國家自然科學(xué)基金委員會、科技部及上海市科學(xué)技術(shù)委員會等的支持。

　　論文鏈接

　?。ˋ）利用肝細(xì)胞特異性的ProTracer標(biāo)記增殖肝細(xì)胞的成體小鼠肝臟。tdTomato⁺的增殖肝細(xì)胞呈現(xiàn)出一圈圈的類似“甜甜圈”的形狀。（B）利用ProTracer揭示成體肝臟中新生肝細(xì)胞（tdTomato⁺）主要來源于E-CAD^–GS^– Zone 2。E-CAD（綠色）；GS（青色）

來源：中科院