最近，北京大學(xué)未來(lái)技術(shù)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程系陳匡時(shí)教授課題組基于雙分子熒光互補(bǔ)（Bimolecular Fluorescence Complementation，BiFC）技術(shù)，發(fā)展了一種可以在納米尺度下研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用的新型成像技術(shù)。該技術(shù)克服了傳統(tǒng)BiFC技術(shù)易產(chǎn)生假陽(yáng)性信號(hào)的問(wèn)題，并被用于在納米尺度下解析宿主細(xì)胞重要蛋白質(zhì)參與HIV-1病毒組裝的工作模式。該研究成果已發(fā)表于學(xué)術(shù)期刊ACS Nano，題目為“A Background Assessable and Correctable Bimolecular Fluorescence Complementation System for Nanoscopic Single-Molecule Imaging of Intracellular Protein-Protein Interactions”。

BiFC技術(shù)是一種可在細(xì)胞內(nèi)成像蛋白質(zhì)相互作用的方法，其原理是將一個(gè)完整的熒光蛋白分割成兩個(gè)非熒光片段，再將這兩個(gè)非熒光片段分別與可能發(fā)生相互作用的兩個(gè)目標(biāo)蛋白連接形成融合蛋白，當(dāng)目標(biāo)蛋白在細(xì)胞內(nèi)相互作用時(shí)，這兩個(gè)非熒光片段會(huì)由于空間距離的靠近形成完整的熒光蛋白。然而，在目標(biāo)蛋白不發(fā)生相互作用的情況下，兩個(gè)非熒光片段也可能由于隨機(jī)碰撞而自組裝成完整的熒光蛋白，產(chǎn)生假陽(yáng)性信號(hào)，這限制了BiFC技術(shù)對(duì)目標(biāo)蛋白相互作用的定量研究。為了克服這一問(wèn)題，陳匡時(shí)課題組開(kāi)發(fā)了一種能夠檢測(cè)并消除這種由非熒光片段自組裝產(chǎn)生的假陽(yáng)性信號(hào)的方法，并將其命名為BAC-BiFC（Background Assessable and Correctable-Bimolecular Fluorescence Complementation）（圖1）。具體來(lái)說(shuō)，他們給BiFC中的一個(gè)目標(biāo)蛋白連接上一個(gè)參考熒光蛋白，該參考熒光蛋白不僅可用來(lái)表征目標(biāo)蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平與空間分布，還使得研究者可以通過(guò)比率成像判斷不同蛋白表達(dá)水平下假陽(yáng)性信號(hào)的強(qiáng)弱，從而獲得不受假陽(yáng)性信號(hào)干擾的實(shí)驗(yàn)條件。

圖1. BAC-BiFC工作原理

“通過(guò)發(fā)展新的超分辨BiFC技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)宿主細(xì)胞AGO2蛋白參與了HIV-1病毒顆粒組裝的全過(guò)程，是病毒增殖不可或缺的原件。這一發(fā)現(xiàn)有望為HIV病毒和其他逆轉(zhuǎn)錄病毒的研究提供新的角度?！标惪飼r(shí)表示。

在HIV-1病毒的增殖過(guò)程中，其結(jié)構(gòu)蛋白Gag需要與眾多宿主細(xì)胞蛋白發(fā)生相互作用以完成病毒顆粒的組裝與出芽。研究者利用BAC-BiFC技術(shù)，在納米尺度下對(duì)Gag蛋白與宿主細(xì)胞蛋白AGO2之間的相互作用進(jìn)行了研究【通過(guò)結(jié)合超分辨率顯微技術(shù)direct stochastic optical reconstruction microscopy（dSTORM）實(shí)現(xiàn)】。與前人的研究結(jié)果不同，研究者發(fā)現(xiàn)Gag蛋白并非只介導(dǎo)病毒顆粒包裝固定數(shù)量的AGO2，而是在病毒組裝后期招募了更多的AGO2（圖2），這提示AGO2參與了HIV-1病毒顆粒組裝的全過(guò)程，是病毒增殖不可或缺的原件。這一發(fā)現(xiàn)有望為HIV-1病毒和其他逆轉(zhuǎn)錄病毒的研究提供新的角度。值得一提的是，除了本工作所涉及的研究對(duì)象外，BAC-BiFC技術(shù)也具有對(duì)生命過(guò)程中其它各類(lèi)蛋白質(zhì)相互作用乃至其它生物分子之間的相互作用進(jìn)行可視化研究的潛力。

圖2. 通過(guò)超分辨率成像解析HIV-1 Gag蛋白和AGO2在細(xì)胞膜上互作，獲得AGO2參與病毒顆粒組裝的模型

陳匡時(shí)課題組的毛詩(shī)琦、應(yīng)亞宸、馬昭是這項(xiàng)工作的共同第一作者，課題組成員楊艷濤也在前期工作中作出貢獻(xiàn)，陳匡時(shí)是本工作的通訊作者。該工作得到了國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃和國(guó)家自然科學(xué)基金的支持。

來(lái)源：北京大學(xué)