新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）的暴發(fā)已經(jīng)在全球范圍內(nèi)引發(fā)了嚴(yán)重的公共衛(wèi)生危機(jī)。SARS-CoV-2是導(dǎo)致COVID-19的主要病原體，它是繼SARS-CoV和MERS-CoV之后第三種對人類具有高致病性的冠狀病毒[1]。研究表明，ACE2（血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2）是介導(dǎo)SARS-CoV-2入胞的高親和力受體，SARS-CoV-2通過其表面刺突蛋白（Spike，S）的受體結(jié)合域（RBD）與ACE2互作而感染細(xì)胞。然而，ACE2在人體器官中的表達(dá)分布與SARS-CoV-2的器官嗜性并不完全相關(guān)。比如，在整個呼吸道、大腦以及多種免疫細(xì)胞中，ACE2的表達(dá)較低或幾乎不表達(dá)，但是這些細(xì)胞仍然可以被SARS-CoV-2感染。因此，可能存在ACE2以外的受體來介導(dǎo)病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞。

目前，已有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)與SARS-CoV-2感染相關(guān)的關(guān)鍵宿主因子，比如基于CRISPR基因敲除系統(tǒng)的高通量功能性篩選。然而，這些篩選均沒有發(fā)現(xiàn)ACE2以外的新受體，這可能是因?yàn)榇祟惢诠δ苋笔У暮Y選是在ACE2的表達(dá)和功能占主導(dǎo)地位的細(xì)胞類型中進(jìn)行的[2-5]。

2021年8月20日，北京大學(xué)魏文勝課題組、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院王健偉課題組與北京大學(xué)肖俊宇課題組在 Science China Life Sciences 雜志聯(lián)合發(fā)表了題為“Genome-wide CRISPR activation screen identifies candidate receptors for SARS-CoV-2 entry”的研究論文，該研究通過基于CRISPR激活（CRISPR activation, CRISPRa）系統(tǒng)的全基因組水平的功能獲得性篩選，發(fā)現(xiàn)了多個介導(dǎo)SARS-CoV-2入侵細(xì)胞的潛在新受體。

為了系統(tǒng)性研究SARS-CoV-2入胞的關(guān)鍵因子，該研究使用SARS-CoV-2假病毒在HEK293T細(xì)胞中進(jìn)行了全基因組CRISPRa篩選。該篩選基于實(shí)驗(yàn)室之前建立的內(nèi)置分子條形碼（iBAR）方法[6]在sgRNA中添加外置條形碼（eBAR），建立sgRNAeBAR文庫，從而可以使用高感染復(fù)數(shù)及較少的細(xì)胞量進(jìn)行高質(zhì)量文庫構(gòu)建。篩選結(jié)果表明，除了發(fā)現(xiàn)已知的SARS-CoV-2受體ACE2、主要宿主細(xì)胞蛋白酶TMPRSS2以及已報道的ACE2依賴性共受體NRP1外，還鑒定出多種新型宿主因子可能參與SARS-CoV-2入胞機(jī)制中（圖1）。

圖1.通過全基因組CRISPRa功能性篩選發(fā)現(xiàn)影響SARS-CoV-2入胞的關(guān)鍵宿主因子

結(jié)合SARS-CoV-2假病毒和真病毒實(shí)驗(yàn)，該研究發(fā)現(xiàn)膜蛋白LDLRAD3、TMEM30A和CLEC4G能夠以不依賴于ACE2的方式有效介導(dǎo)病毒入侵細(xì)胞。此外，研究證實(shí)這些膜蛋白都能夠與SARS-CoV-2 S蛋白結(jié)合。與ACE2結(jié)合S蛋白的RBD不同，這些蛋白能夠特異性結(jié)合S蛋白的N末端結(jié)構(gòu)域（NTD）（圖2）。LDLRAD3在神經(jīng)元中高度表達(dá)，最近作為委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒（VEEV）的關(guān)鍵受體受到關(guān)注。實(shí)驗(yàn)表明，敲低LDLRAD3或在細(xì)胞上清中加入其可溶性蛋白可顯著降低SARS-CoV-2對神經(jīng)元細(xì)胞的感染。CLEC4G在肝臟、淋巴結(jié)和單核細(xì)胞中高度表達(dá)，已知其作為細(xì)胞粘附因子促進(jìn)SARS-CoV感染宿主；通過在肝臟細(xì)胞中進(jìn)行敲低實(shí)驗(yàn)證實(shí)了CLEC4G在SARS-CoV-2入侵細(xì)胞中的重要作用?？缒さ鞍譚MEM30A在最近的SARS-CoV-2全基因組敲除篩選（Huh7.5細(xì)胞）中也被鑒定出來[4]，研究進(jìn)一步證實(shí)了其對于SARS-CoV-2入胞的重要性以及其與S蛋白的直接結(jié)合。這些具有組織特異性或廣譜表達(dá)的新受體的發(fā)現(xiàn)，有助于進(jìn)一步揭示SARS-CoV-2的多器官嗜性，并為探究COVID-19的新治療靶點(diǎn)提供線索。

圖2.SARS-CoV-2感染實(shí)驗(yàn)證實(shí)LDLRAD3、CLEC4G和TMEM30A為介導(dǎo)SARS-CoV-2入胞的潛在受體

北京大學(xué)魏文勝課題組博士后朱詩優(yōu)博士、劉瑩博士、副研究員周卓博士和肖俊宇課題組博士生張志瑩為該論文的共同第一作者。該研究項(xiàng)目得到了國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國家自然科學(xué)基金、傳染病防治國家科技重大專項(xiàng)、北京市科委生命科學(xué)前沿創(chuàng)新培育項(xiàng)目、北京未來基因診斷高精尖創(chuàng)新中心、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心以及中國博士后科學(xué)基金的支持。

參考文獻(xiàn)：

1. Andersen, K.G., Rambaut, A., Lipkin, W.I., Holmes, E.C., and Garry, R.F. (2020). The proximal origin of SARS-CoV-2. Nat Med 26, 450-452.

2. Wei, J., Alfajaro, M.M., DeWeirdt, P.C., Hanna, R.E., Lu-Culligan, W.J., Cai, W.L., Strine, M.S., Zhang, S.M., Graziano, V.R., Schmitz, C.O., et al. (2021). Genome-wide CRISPR Screens Reveal Host Factors Critical for SARS-CoV-2 Infection. Cell 184, 76-91 e13.

3. Daniloski, Z., Jordan, T.X., Wessels, H.H., Hoagland, D.A., Kasela, S., Legut, M., Maniatis, S., Mimitou, E.P., Lu, L., Geller, E., et al. (2021). Identification of Required Host Factors for SARS-CoV-2 Infection in Human Cells. Cell 184, 92-105 e116.

4.Baggen, J., Persoons, L., Vanstreels, E., Jansen, S., Van Looveren, D., Boeckx, B., Geudens, V., De Man, J., Jochmans, D., Wauters, J., et al.(2021). Genome-wide CRISPR screening identifies TMEM106B as a proviral host factor for SARS-CoV-2. Nat Genet. 53(4), 435-444.

5. Zhu, Y., Feng, F., Hu, G., Wang, Y., Yu, Y., Zhu, Y., Xu, W., Cai, X., Sun, Z., Han, W., et al. (2021). A genome-wide CRISPR screen identifies host factors that regulate SARS-CoV-2 entry. Nature communications 12, 961.

6. Zhu, S., Cao, Z., Liu, Z., He, Y., Wang, Y., Yuan, P., Li, W., Tian, F., Bao, Y., and Wei, W. (2019). Guide RNAs with embedded barcodes boost CRISPR-pooled screens. Genome Biol 20, 20.

來源：北京大學(xué)