2021年10月28日，北京大學生命科學學院、北大-清華生命科學聯(lián)合中心伊成器教授課題組在Nature Chemical Biology雜志發(fā)表題為“Increasing the efficiency and precision of prime editing with guide RNA pairs”的研究論文，開發(fā)了人源細胞中基于雙pegRNA的高效引導編輯新策略。

引導編輯（Prime Editing）可實現(xiàn)所有的12種堿基替換，還可以實現(xiàn)小片段堿基插入和刪除。引導編輯以CRISPR/Cas9系統(tǒng)為基礎，將nCas9（H840A）與逆轉(zhuǎn)錄酶融合，獲得新的融合蛋白。此外，sgRNA的3’末端增加一段攜帶目標突變的RNA序列，獲得的sgRNA被稱作pegRNA（prime editing guide RNA）。引導編輯理論上可以糾正多達89%的人類致病突變，但如何進一步提高其效率和精準度仍舊是一個挑戰(zhàn)。

本研究通過設計分別靶向DNA雙鏈的兩條pegRNA，對基因組的同一個位點進行編輯，從而實現(xiàn)引導編輯效率的提升。由于兩條pegRNA含有同源的3’末端，因此，該策略被命名為“HOPE”（HOmologous 3′ Extensions Mediated Prime Editor）。通過與原始引導編輯工具的一系列比較，證實HOPE在堿基替換、插入和刪除方面的效率顯著高于PE2，且副產(chǎn)物遠少于PE3。此外，本研究探究了一系列影響HOPE效率的因素，包括DNA雙鏈上PAM之間的距離、PBS的長度和退火值以及RT的長度，提供了一套優(yōu)化的雙pegRNA設計原則。進一步，本研究利用Cas-OFFinder軟件預測了pegRNA依賴型的脫靶區(qū)域，并對其進行擴增子靶向測序，證實了HOPE策略與原始引導編輯系統(tǒng)都具有很高的特異性。

HOPE策略的工作原理圖

綜上，本研究利用雙pegRNA策略，顯著提高了引導編輯的效率。通過在一系列內(nèi)源位點及不同細胞系上的驗證，證實HOPE策略提供了效率與精準度高度平衡的引導編輯新選擇。

伊成器為本文的通訊作者。生命科學學院博士生莊元、北大-清華生命科學聯(lián)合中心博士生劉江樂以及博士生烏浩為本文共同第一作者。生命科學學院本科生朱擎國、北大-清華生命科學聯(lián)合中心博士生閆永昌以及生命科學學院博士后孟浩巍對本文作出了重要貢獻。本文得到了北京大學化學與分子工程學院、北大-清華生命科學聯(lián)合中心陳鵬教授的指導和支持。該研究得到了國家自然科學基金、科技部重點研發(fā)計劃、北大-清華生命科學聯(lián)合中心的資助。

來源：北京大學