2014年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予了熒光超分辨顯微技術(shù)，利用熒光分子的化學(xué)開關(guān)特性（PALM/FPALM/STORM）或者物理的直接受激輻射現(xiàn)象（STED），實(shí)現(xiàn)超越衍射極限的超分辨成像。盡管如此，活細(xì)胞中的超分辨率成像仍然存在兩個(gè)主要瓶頸：

（1）超分辨率的光毒性限制了觀察活細(xì)胞中精細(xì)生理過程；（2）受限于熒光分子單位時(shí)間內(nèi)發(fā)出的光子數(shù)，時(shí)間和空間分辨率不可兼得。

受限于這個(gè)瓶頸，為了在活細(xì)胞上達(dá)到60nm空間分辨率極限，現(xiàn)有超分辨率成像手段需要強(qiáng)照明功率（kW~MW/mm²）、特殊熒光探針和長曝光時(shí)間（>2 s）。強(qiáng)照明功率引起的強(qiáng)漂白會(huì)破壞真實(shí)熒光結(jié)構(gòu)的完整性，長曝光時(shí)間在圖像重構(gòu)時(shí)導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)偽影，降低有效分辨率。迄今為止，基于光學(xué)硬件或者熒光探針的改進(jìn)無法進(jìn)一步提升活細(xì)胞超分辨率的時(shí)空分辨率，實(shí)現(xiàn)毫秒尺度60nm的時(shí)空分辨率成像。

2021年11月16日，北京大學(xué)未來技術(shù)學(xué)院陳良怡教授團(tuán)隊(duì)與哈爾濱工業(yè)大學(xué)儀器科學(xué)與工程學(xué)院李浩宇教授團(tuán)隊(duì)合作，在Nature Biotechnology（2020年IF54.908）上發(fā)表論文“Sparse deconvolution improves the resolution of live-cell super-resolution fluorescence microscopy”。他們另辟蹊徑，發(fā)明基于新計(jì)算原理的熒光超分辨率顯微成像，進(jìn)一步拓展熒光顯微鏡的分辨率極限。通過提出“熒光圖像的分辨率提高等價(jià)于圖像的相對稀疏性增加”這個(gè)通用先驗(yàn)知識(shí)，結(jié)合之前提出的信號(hào)空時(shí)連續(xù)性先驗(yàn)知識(shí)，他們發(fā)明了兩步迭代解卷積算法，即稀疏解卷積（Sparse deconvolution）方法，突破現(xiàn)有熒光顯微系統(tǒng)的光學(xué)硬件限制，首次實(shí)現(xiàn)通用計(jì)算熒光超分辨率成像。結(jié)合自主研發(fā)的超分辨率結(jié)構(gòu)光（SIM）系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)目前活細(xì)胞光學(xué)成像中最高空間分辨率（60nm）下，速度最快（564Hz）、成像時(shí)間最長（1小時(shí)以上）的超分辨成像。結(jié)合商業(yè)的轉(zhuǎn)盤共聚焦結(jié)構(gòu)光顯微鏡，實(shí)現(xiàn)四色、三維、長時(shí)間的活細(xì)胞超分辨成像。

1.應(yīng)用舉例：Sparse-SIM超快活細(xì)胞成像揭示核孔結(jié)構(gòu)和胰島素囊泡早期融合孔道

在活細(xì)胞成像中，稀疏結(jié)構(gòu)光顯微鏡（Sparse-SIM）可以解析標(biāo)記不同核孔蛋白（Nup35、 Nup93、Nup98或Nup107）的環(huán)狀核孔結(jié)構(gòu)，而它們在傳統(tǒng)結(jié)構(gòu)光顯微鏡（2D-SIM）下形狀大小與100nm熒光珠類似（圖1c，2d）。由于相機(jī)像素尺寸與孔徑直徑類似，測量的核孔擬合直徑與Sparse-SIM的分辨率相當(dāng)。校正后Nup35和Nup107孔的直徑分別為~66±3 nm和~97±5 nm，而Nup98和Nup93直徑大小處于這個(gè)范圍中（圖1e，1f），結(jié)果與以前用其他超分辨成像方法在固定細(xì)胞中獲得的直徑相符。有趣的是，12分鐘超分辨成像可以顯示活細(xì)胞中核孔形狀變化，這可能反映了核膜上的單個(gè)核孔復(fù)合物動(dòng)態(tài)重新定向到焦平面或遠(yuǎn)離焦平面（圖1g），這是其他超分辨方法難以觀察到的。

圖1 Sparse-SIM解析核孔蛋白動(dòng)態(tài)過程。（c）用Sparse-SIM觀察活COS-7細(xì)胞中以Nup98-GFP標(biāo)記的動(dòng)態(tài)環(huán)狀核孔的典型例子，持續(xù)時(shí)間超過10分鐘。上下區(qū)域分別顯示2D-SIM和Sparse-SIM下的圖像。（d）比較（c）中青色框中的核孔結(jié)構(gòu)快照與100 nm熒光珠在不同重建方法（2D-SIM、20次RL解卷積后、50次RL解卷積后、Sparse-SIM）下的結(jié)果。（e）矯正后得Nup35-GFP（紅色）、Nup98-GFP（黃色）、Nup93-GFP（綠色）和Nup107-GFP（青色）標(biāo)記的核孔結(jié)構(gòu)的實(shí)際直徑（詳情請見文章）。（f）Nup35（66±3nm, n=30）、Nup98（75±6nm，n=40）、Nup93（79±4nm，n=40）、Nup107（97±5nm，n=40）的平均直徑環(huán)。左右兩幅蒙太奇分別為傳統(tǒng)Wiener重構(gòu)或稀疏解卷積后的結(jié)果。（g）在6個(gè)時(shí)間點(diǎn)對（c）中的品紅色方框放大并顯示。比例尺：（c）500nm；（d，g，f）100nm。

通過滾動(dòng)重建，Sparse-SIM的時(shí)間分辨率可達(dá)564Hz，識(shí)別出來INS-1細(xì)胞中VAMP2-pHluorin標(biāo)記的、更小的胰島素囊泡融合孔道（如~61nm孔徑，圖2o，2p）。它們在囊泡融合的早期出現(xiàn)，孔徑?。ㄆ骄睆絶87nm），持續(xù)時(shí)間短（9.5ms），不能被之前傳統(tǒng)的TIRF-SIM所識(shí)別。另一方面，鑒別出來的穩(wěn)定融合孔在囊泡融合的后期出現(xiàn)，孔徑大（平均直徑~116nm），持續(xù)時(shí)間長（47ms）（圖2q），是之前看到的結(jié)構(gòu)。值得一提的是，雖然這里發(fā)現(xiàn)的囊泡早期融合孔狀態(tài)很難被其他的超分辨率成像手段所直接驗(yàn)證，但是它們的發(fā)生頻率與30多年前用快速冷凍蝕刻電子顯微鏡所觀察到的“小的融合孔發(fā)生概率遠(yuǎn)低于大的融合孔”現(xiàn)象相吻合。

圖2 Sparse-SIM解析超快胰島素代謝過程。（n）不同種類囊泡的平均直徑。（o）囊泡融合事件的代表性蒙太奇圖像。（p）TIRF-SIM（上）和Sparse-SIM（下）記錄的囊泡分泌Kymograph圖。（q）早期（黃色）和穩(wěn)定（綠色）融合孔的平均打開時(shí)間（左）、直徑（中）和持續(xù)時(shí)間（右）。比例尺：【a，e，m（top）】5?μm；（b，j）500?nm；【h，m （bottom）】1μm；（k）100nm。

2.應(yīng)用舉例：稀疏解卷積是提升熒光顯微鏡分辨率的通用方法

與當(dāng)下熱門的深度學(xué)習(xí)超分辨率顯微重建不同，信號(hào)的空時(shí)連續(xù)性、高空間分辨率導(dǎo)致的熒光圖像相對稀疏性這兩個(gè)先驗(yàn)知識(shí)，是熒光顯微成像的通用先驗(yàn)知識(shí)，不依賴于樣本的形態(tài)以及特定的熒光顯微鏡種類。因此，稀疏解卷積是通用熒光顯微計(jì)算超分辨率成像算法，可被廣泛應(yīng)用于提升其他熒光顯微模態(tài)分辨率，觀察不同種類細(xì)胞器的精細(xì)結(jié)構(gòu)及動(dòng)態(tài)。

比如稀疏解卷積增強(qiáng)的商業(yè)超分辨轉(zhuǎn)盤共焦結(jié)構(gòu)光顯微鏡（SD-SIM），可以實(shí)現(xiàn)XY方向90納米，Z方向250納米的空間分辨率，清晰記錄分裂期7μm深度內(nèi)的全細(xì)胞內(nèi)所有線粒體外膜網(wǎng)絡(luò)（圖3）。同樣，若稀疏解卷積增強(qiáng)與商業(yè)SD-SIM結(jié)合，可以很容易實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞上的三維、四色超分辨率成像。稀疏解卷積可以與膨脹顯微鏡結(jié)合，解析細(xì)胞膨脹后的復(fù)雜結(jié)構(gòu)；也可以與寬場、點(diǎn)掃描的共聚焦、受激輻射損耗顯微鏡以及微型化雙光子顯微鏡結(jié)合，實(shí)現(xiàn)近兩倍的空間分辨率提升。因此，稀疏解卷積的提出，將幫助使用各種各樣熒光顯微鏡的生物醫(yī)學(xué)研究者更好地分辨細(xì)胞中的精細(xì)動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)。

圖3 Sparse SD-SIM解析活細(xì)胞三維線粒體外膜網(wǎng)絡(luò)。（k）活體COS-7細(xì)胞的線粒體外膜（Tom20-mCherry標(biāo)記）的三維分布，顏色表征深度。（l）SD-SIM原始數(shù)據(jù)與Sparse SD-SIM的水平（左）和垂直（右）的白色框區(qū)域放大展示。比例尺：（k）5μm；（l）1μm。

總之，通過稀疏解卷積算法（Sparse deconvolution）來實(shí)現(xiàn)計(jì)算熒光超分辨率成像，與目前基于特定物理原理或者特殊熒光探針的超分辨率方法都不相同。與超快結(jié)構(gòu)光超分辨顯微鏡結(jié)合形成的Sparse-SIM是目前活細(xì)胞光學(xué)成像中，分辨率最高（60納米）、速度最快（564幀/秒）、成像時(shí)間最長（1小時(shí)以上）的超分辨光學(xué)顯微成像手段。它也可以與現(xiàn)有的多數(shù)商業(yè)熒光顯微鏡結(jié)合，有效提升它們的空間分辨率，看到更清楚的精細(xì)結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)。

哈爾濱工業(yè)大學(xué)博士生趙唯淞、北京大學(xué)博士后趙士群、李柳菊為共同第一作者，李浩宇和陳良怡為論文共同通訊作者，共同作者還包括哈爾濱工業(yè)大學(xué)譚久彬院士、劉儉教授，北京大學(xué)毛珩博士、生科院成像平臺(tái)單春燕博士和華南師范大學(xué)劉彥梅教授。參與合作的實(shí)驗(yàn)室包括武漢大學(xué)宋保亮教授、北京大學(xué)陳興教授、中科院國家納米科學(xué)中心丁寶全教授和生物物理所紀(jì)偉教授等。該項(xiàng)工作受到國家自然科學(xué)基金委重大研究計(jì)劃、杰出青年基金，科技部重點(diǎn)研發(fā)專項(xiàng)，中國科協(xié)青年托舉工程，黑龍江省自然科學(xué)基金優(yōu)青，北京市科委、北京市自然基金委和北京大學(xué)博雅博士后計(jì)劃等項(xiàng)目資助，得到北京大學(xué)膜生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、麥戈文腦研究所、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心、北京智源人工智能研究院的支持，也是多模態(tài)跨尺度國家生物醫(yī)學(xué)成像設(shè)施建設(shè)過程中的重要成果。

來源：北京大學(xué)