三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）、腺苷（Adenosine，Ado）等嘌呤類分子細胞內(nèi)外廣泛存在。胞內(nèi)的嘌呤類分子主要負責(zé)調(diào)控細胞能量代謝等過程；而胞外的嘌呤類分子則作為信號分子（被稱為“嘌呤類遞質(zhì)”），通過作用在其相應(yīng)受體調(diào)節(jié)呼吸調(diào)控、味覺感受、睡眠等生理活動；嘌呤類遞質(zhì)及其受體還參與調(diào)節(jié)癲癇、疼痛、炎癥反應(yīng)、腦外傷和缺血等病理狀態(tài)。此外，嘌呤能信號失調(diào)還與抑郁、精神分裂癥等精神類疾病密切相關(guān)。迄今，解密嘌呤能信號傳遞功能的一大技術(shù)瓶頸是缺乏靈敏、特異且非侵入性的工具，以高時空分辨率地報告嘌呤類遞質(zhì)的動態(tài)變化。

2021年12月22日，北京大學(xué)李毓龍實驗室在Neuron雜志在線發(fā)表了題為“A sensitive GRAB sensor for detecting extracellular ATP in vitro and in vivo”的研究論文，報道了新型基因編碼的ATP探針GRAB_ATP1.0的開發(fā)和在體外及活體動物的應(yīng)用。李毓龍實驗室自2018年以來，先后開發(fā)了針對乙酰膽堿、多巴胺、去甲腎上腺素、腺苷、五羥色胺、內(nèi)源大麻素等神經(jīng)遞質(zhì)或調(diào)質(zhì)的熒光探針，此次發(fā)表的GRABATP1.0是其又一力作，進一步擴展了GRAB系列熒光探針家族。

論文截圖

在這一工作中，李毓龍實驗室運用其先前設(shè)計的GRAB探針策略（GPCR Activation-Based sensor)，基于人源ATP受體P2Y₁和循環(huán)重排的綠色熒光蛋白cpEGFP開發(fā)了ATP探針GRAB_ATP1.0（簡稱為ATP1.0）。在體外培養(yǎng)的HEK293T細胞、原代神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細胞中，ATP1.0探針均表現(xiàn)出優(yōu)異的細胞膜定位。神經(jīng)元表達的ATP1.0對外源加入的ATP及ADP有~780%的信號響應(yīng)、~80 nM的親和力（EC₅₀），及高度的分子特異性（圖1）。此外，ATP1.0能夠在亞秒級別響應(yīng)胞外ATP濃度的變化。

圖1：ATP1.0在HEK293T細胞、星形膠質(zhì)細胞及神經(jīng)元上的表現(xiàn)

ATP1.0探針能否用來檢測內(nèi)源釋放的ATP呢？作者從原代培養(yǎng)的海馬細胞入手，發(fā)現(xiàn)ATP1.0能夠檢測到機械刺激及低滲透壓刺激引發(fā)的ATP釋放，藥理學(xué)實驗及突變型探針實驗進一步驗證了ATP1.0檢測信號的特異性（圖2）。有意思的是，在不給予額外刺激時，ATP1.0也能靈敏地記錄到直徑約為30微米的自發(fā)性ATP釋放事件，表明ATP的釋放具有化學(xué)分子特異和空間特異性。

圖2：ATP1.0在原代培養(yǎng)的海馬細胞中檢測內(nèi)源ATP的釋放

ATP1.0探針能否在活體動物加以運用呢？過去的研究發(fā)現(xiàn)，當細胞受到損傷時，胞內(nèi)毫摩爾級別的ATP被釋放胞外，作為“危險信號”被周圍的膠質(zhì)細胞感受，從而激活小膠質(zhì)細胞釋放趨化因子等，產(chǎn)生免疫反應(yīng)。膠質(zhì)細胞上表達的嘌呤類受體在小膠質(zhì)細胞激活、遷移及分泌信號因子過程中發(fā)揮重要作用。那么，在這一過程中，信號分子ATP的傳播和小膠質(zhì)細胞的遷移是如何動態(tài)并變化的？作者將ATP1.0探針表達在斑馬魚中，通過激光照射引發(fā)局部損傷時發(fā)現(xiàn)ATP的釋放呈現(xiàn)“波狀”傳播；通過將綠色ATP1.0探針表達在紅色熒光蛋白標記小膠質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)基因斑馬魚中，能夠直觀地檢測到隨著ATP信號的傳播小膠質(zhì)細胞的遷移過程（圖3上）。

圖3：ATP1.0報告斑馬魚受到局部損傷時及小鼠發(fā)生免疫反應(yīng)時大腦中的胞外ATP信號

當大腦處于疾病狀態(tài)時，ATP的釋放又會呈現(xiàn)什么樣的變化？如上所述，嘌呤能信號在免疫中扮演著重要角色。為了檢測免疫反應(yīng)過程中大腦中ATP信號的變化，作者通過腹腔注射脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）的方式引發(fā)小鼠的系統(tǒng)性免疫反應(yīng)，同時通過AAV病毒介導(dǎo)的方法將ATP1.0表達在小鼠的大腦皮層，并借助雙光子成像記錄ATP的信號。有意思的是，LPS注射后，小鼠大腦皮層呈現(xiàn)出強烈、但空間特異的ATP信號上升現(xiàn)象（見視頻）。

視頻：腹腔注射LPS的小鼠炎癥模型中大腦皮層ATP信號的變化，注意局部ATP釋放的信號

除了開發(fā)高靈敏的ATP1.0探針外，作者還開發(fā)了反應(yīng)動力學(xué)更快及親和力更低的ATP探針ATP1.0-L。在神經(jīng)元中表達的ATP1.0-L對胞外的ATP的親和力（EC₅₀）約為32 μM。當在原代培養(yǎng)的海馬細胞及活體的斑馬魚中表達，ATP1.0-L均能檢測到更加局部的ATP信號。

綜上所述，在這項工作中作者開發(fā)了新型遺傳編碼的ATP熒光探針，實現(xiàn)了對胞外ATP的高時空分辨率的記錄。在此之前，李毓龍課題組在2020年還開發(fā)了另外一種嘌呤類遞質(zhì)腺苷的GRAB熒光探針，并助力中國科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心徐敏團隊在睡眠調(diào)控中的研究。相信一系列新型成像工具的開發(fā)，將助力科學(xué)家更加深入地研究嘌呤能信號傳遞在生理和病理條件下的功能和調(diào)控機理。

北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院博士后武照伐為本文第一作者，李毓龍教授和武照伐博士為共同通訊作者，本科畢業(yè)生何凱凱、博士研究生潘孫磊、李柏翰、鄧飛和王歡等對文章作出了重要貢獻。北大研究團隊與北京腦科學(xué)與類腦研究中心井淼團隊（陳閱、席鳳雪）及中國科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心杜久林團隊（李紅羽、劉亭亭）等展開通力合作，該工作得到了北京大學(xué)膜生物學(xué)國家重點實驗室、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心、國家自然科學(xué)基金、北京市科委、峰基金及勃林格殷格翰博士后獎學(xué)金等機構(gòu)和經(jīng)費的大力支持。

來源：北京大學(xué)