2022年9月15日，北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院季雄研究員課題組在Molecular Cell雜志在線發(fā)表了題為“Targeted protein degradation reveals RNA Pol II heterogeneity and functional diversity”的研究論文。該研究系統(tǒng)闡釋了真核生物細(xì)胞中RNA聚合酶II各亞基對轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后過程的直接調(diào)控作用和潛在機(jī)制，首次表明RNA聚合酶II是一個優(yōu)化酶（Optimized polymerase, OPPO）, 其亞基在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后過程中發(fā)揮著不同甚至特異的作用。

論文截圖

RNA聚合酶II主要負(fù)責(zé)蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)錄，是由12個亞基組成的蛋白復(fù)合體。領(lǐng)域內(nèi)一直認(rèn)為RNA聚合酶是作為一個整體發(fā)揮功能的全酶（holoenzyme），由于組成RNA聚合酶的亞基是必需基因，傳統(tǒng)干擾手段處理時間較長，不可避免地會引入二級效應(yīng)，因此其亞基的直接調(diào)控功能不清楚而且被長期忽視。此外令人困惑的是，RNA聚合酶亞基應(yīng)該是組成性表達(dá)的，但是其失調(diào)和變異常常會伴隨不同組織中的不同疾病，特別是腦部疾病。

研究者首先在小鼠胚胎干細(xì)胞中建立了RNA聚合酶II的12個亞基的瞬時降解細(xì)胞系，聯(lián)合染色質(zhì)基因組與蛋白質(zhì)組分別定量各個亞基的染色質(zhì)互作基因組位點和蛋白質(zhì)。結(jié)果顯示各亞基在基因組范圍內(nèi)呈現(xiàn)非均一占位、互作蛋白存在顯著差異，例如RPB4與RPB7相較于其他亞基，其與轉(zhuǎn)錄延伸調(diào)控蛋白NELF復(fù)合物的互作強(qiáng)度明顯較低。結(jié)合定量質(zhì)譜和分子篩生化分析，研究者同樣發(fā)現(xiàn)了各亞基在轉(zhuǎn)錄過程中呈現(xiàn)非均一的互作甚至可能存在從全酶解離的過程。

接著，研究者使用新生RNA測序?qū)嶒灒≒RO-Seq）探究各亞基瞬時降解后（1h）對新生RNA生成的影響。有趣的是，不同亞基的降解可產(chǎn)生不同程度的轉(zhuǎn)錄失衡，而一些亞基如RPB4、RPB9、RPB11、RPB12的降解不影響新生RNA生成，表明這些亞基瞬時降解后，不影響轉(zhuǎn)錄過程。與此同時，研究者繼續(xù)使用染色質(zhì)RNA測序?qū)嶒灒–hAR-Seq）對部分亞基降解后轉(zhuǎn)錄失衡現(xiàn)象進(jìn)行了驗證，得出相同的結(jié)論，表明數(shù)據(jù)的可靠性。隨后，研究者通過WGCNA分析，將RNA聚合酶II復(fù)合物各亞基在染色質(zhì)定位情況與降解后不同基因的轉(zhuǎn)錄情況進(jìn)行了關(guān)聯(lián)性分析，發(fā)現(xiàn)亞基在基因的結(jié)合強(qiáng)度越高，該基因的轉(zhuǎn)錄越依賴該亞基，暗示亞基對不同基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控存在基因特異性。

為了進(jìn)一步證實上述猜想，研究者開展了長時程降解（12h）后的PolyA-RNA-Seq實驗，探究各亞基對不同基因成熟mRNA的影響。研究者發(fā)現(xiàn)RPB1、RPB2、RPB5、RPB6、RPB7、RPB8的降解可導(dǎo)致大部分基因轉(zhuǎn)錄下降，表明這些亞基參與RNA聚合酶全酶穩(wěn)定性，這與免疫熒光成像實驗中這些亞基降解后導(dǎo)致核內(nèi)全酶顯著降低的結(jié)果相呼應(yīng)，然而RPB4和RPB12的降解在多個獨立實驗中均沒有呈現(xiàn)變化，研究者認(rèn)為它們可能存在蛋白剪接變體代償了亞基降解的影響。有意思的是RPB3、RPB9、RPB10和RPB11的降解僅造成部分基因轉(zhuǎn)錄下降，免疫熒光成像實驗顯示延長降解時間，核內(nèi)仍然保留部分RNA聚合酶II復(fù)合物，暗示這類亞基在全酶中起調(diào)控作用。

多學(xué)科實驗技術(shù)和生物信息學(xué)分析，系統(tǒng)闡釋了真核生物細(xì)胞中RNA聚合酶II各亞基對轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后過程的直接調(diào)控作用

PolyA-RNA-Seq實驗結(jié)果同時顯示一些亞基降解后可導(dǎo)致部分基因不同程度的表達(dá)上調(diào)，研究者分析基因上調(diào)可能是轉(zhuǎn)錄后過程的失調(diào)造成的，如轉(zhuǎn)錄本3’末端加工缺陷、剪接加工缺陷等。使用前人開發(fā)的Dogfinder軟件，研究者鑒定出亞基降解前后存在轉(zhuǎn)錄通讀的基因類別，隨后結(jié)合基因3’末端加工系數(shù)的計算，發(fā)現(xiàn)RPB1、RPB3、RPB5、RPB8降解后可顯著增加轉(zhuǎn)錄通讀，這與Robert Roeder實驗室2020年在Molecular Cell發(fā)表文章發(fā)現(xiàn)RPB1-CTD降解后造成基因通讀的結(jié)果相吻合。同時研究者通過rMATs對轉(zhuǎn)錄剪接異常的基因進(jìn)行鑒定，同樣發(fā)現(xiàn)不同亞基的降解可造成不同基因的剪接異常。更深入地，研究者對造成轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后3’末端加工和剪接異常的潛在因素進(jìn)行探索后，發(fā)現(xiàn)如DNA序列、RNA結(jié)合蛋白和RNA二級結(jié)構(gòu)等多種因素參與決定亞基特異性的調(diào)控。

中國剪紙十二生肖代表RNA聚合酶II的12個亞基，占據(jù)在全酶復(fù)合體結(jié)構(gòu)中的相對位置，構(gòu)成了最吉祥的漢字“?！薄Ｔ撗芯繄蟮懒?2個亞基優(yōu)化RNA聚合酶II功能的基礎(chǔ)

RNA聚合酶亞基工作中，季雄是該論文的通訊作者，生命科學(xué)學(xué)院李圓君博士和黃捷博士是該論文的共同第一作者。北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院博士研究生朱峻毅、包麗君，西湖大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院郭天南、朱怡課題組等為該工作提供了重要幫助。

2022年9月16日，季雄課題組聯(lián)合北大定量生物學(xué)中心齊志研究員課題組在iScience雜志上發(fā)表了題為“CTCF DNA binding domain undergoes dynamic and selective protein–protein interactions”的研究論文，該文章揭示了CTCF的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA-binding Domain，DBD）能以不依賴無序結(jié)構(gòu)域的方式形成動態(tài)的自聚集簇，在三維細(xì)胞核中能和絕緣子相關(guān)蛋白共聚集、和活躍轉(zhuǎn)錄因子不共定位，這一發(fā)現(xiàn)為解析CTCF的絕緣機(jī)制提供了一種全新的角度。

論文截圖

CTCF（CCCTC-binding factor）是脊椎動物體內(nèi)目前已知的最主要的絕緣子結(jié)合蛋白，其可以阻斷增強(qiáng)子對啟動子的激活，抑制基因的表達(dá)，也可以作為“屏障”阻止異染色質(zhì)的擴(kuò)散。染色質(zhì)構(gòu)象捕獲技術(shù)結(jié)果顯示CTCF能促進(jìn)染色質(zhì)環(huán)結(jié)構(gòu)的形成，通過與Cohesin形成染色質(zhì)環(huán)，折疊成有助于增強(qiáng)子和啟動子互作的三維染色質(zhì)構(gòu)象。但在三維細(xì)胞核中CTCF如何阻礙染色質(zhì)環(huán)內(nèi)的增強(qiáng)子對環(huán)外基因啟動子的激活，以及CTCF的各個結(jié)構(gòu)域和絕緣子功能有怎樣的關(guān)系鮮有報道。

研究者利用光誘導(dǎo)蛋白聚集的“optoDroplet”系統(tǒng)篩選到CTCF的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域能發(fā)生聚集；并在體外驗證CTCF的DBD能聚集形成動態(tài)的液滴；接下來研究者通過蛋白共定位分析結(jié)合活細(xì)胞追蹤成像，發(fā)現(xiàn)CTCF DBD的聚集能招募絕緣相關(guān)蛋白CHD8和BRD2，同時排開轉(zhuǎn)錄激活因子OCT4；通過對已發(fā)表的CTCF ChIP-Seq數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，研究者發(fā)現(xiàn)基因組上CTCF的基序越多，絕緣能力越強(qiáng)，并在表征絕緣活性的熒光素酶報告系統(tǒng)中插入不同數(shù)目的CTCF結(jié)合基序進(jìn)行了驗證。鋅指結(jié)構(gòu)是經(jīng)典的結(jié)合核酸的蛋白結(jié)構(gòu)域，為進(jìn)一步探索核酸對CTCF DBD聚集的影響，研究者通過在體外相變體系加入核酸，在細(xì)胞實驗上利用破壞核酸結(jié)合能力的突變體等證明了核酸抑制CTCF DBD的聚集。此外，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)CTCF DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的精氨酸存在大量突變，該突變會影響CTCF DBD的DNA結(jié)合和絕緣能力?？傊芯空呤状伟l(fā)現(xiàn)CTCF的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以發(fā)生自聚集，后續(xù)也驗證了其它轉(zhuǎn)錄因子例如BCL6、GATA3、YY1的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域也能形成聚集，并能和功能相關(guān)蛋白共定位，同時P53蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域內(nèi)癌癥相關(guān)突變體R175H能降低其聚集體的穩(wěn)定性，這些結(jié)果表明，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的聚集可能是一種較為普遍的轉(zhuǎn)錄因子的功能調(diào)控機(jī)制。

CTCF的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域能和絕緣相關(guān)蛋白發(fā)生動態(tài)和特異性的相互作用

CTCF絕緣機(jī)制工作中，季雄、齊志為本論文共同通訊作者。北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院周蓉博士、田凱博士、黃捷博士為本論文共同第一作者。北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院博士研究生段文嘉、付紅燁，上?？萍即髮W(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院馬涵慧教授和馮穎等為該工作提供了重要幫助。這兩個工作得到科技部國家重點研發(fā)計劃、啟東創(chuàng)新基金、國家自然科學(xué)基金、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心和細(xì)胞增殖與分化教育部重點實驗室的資助。北京大學(xué)鳳凰工程多個儀器平臺對本項目提供了大力支持。

來源：北京大學(xué)