戊型肝炎病毒（Hepatitis E Virus，HEV）是全球范圍內(nèi)病毒性肝炎最主要的病原體之一。慢性肝病患者、孕婦、老年人是HEV感染的高危人群。慢乙肝患者重疊感染戊肝后，肝衰竭發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)升高至10.9倍，死亡風(fēng)險(xiǎn)升高至8.54倍。有報(bào)道顯示孕婦特別是妊娠晚期孕婦的病死率高達(dá)15-25%，且死胎率、早產(chǎn)率高。老年人感染HEV容易導(dǎo)致重型肝炎，占比達(dá)14%。近年來的研究還顯示器官移植等免疫抑制人群感染HEV還可能導(dǎo)致慢性化肝炎，加快肝硬化進(jìn)展（約10%）。此外，研究還表明HEV感染會(huì)導(dǎo)致多種肝外臨床表現(xiàn)，顯示出包括神經(jīng)系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)等多種肝外疾病伴隨轉(zhuǎn)氨酶異常。同時(shí)，多項(xiàng)血液中心研究結(jié)果均提示無癥狀的隱性HEV攜帶者正在給輸血安全帶來新的挑戰(zhàn)。

戊肝的臨床診斷主要依賴于宿主抗體免疫應(yīng)答檢測(cè)和病毒核酸檢測(cè)等診斷方法。作為RNA病毒，HEV的核酸檢測(cè)存在操作復(fù)雜、成本高、易污染等問題，目前國內(nèi)戊肝診斷常用的指標(biāo)是HEV IgM的檢測(cè)，臨床上尚普遍缺乏簡(jiǎn)單易行的病原體檢測(cè)手段。夏寧邵教授團(tuán)隊(duì)前期圍繞戊肝診斷新方法展開研究并取得了一系列成果，發(fā)現(xiàn)了HEV在復(fù)制過程中編碼病毒衣殼抗原的orf2基因會(huì)同時(shí)編碼一個(gè)分泌型的蛋白pORF2^S，pORF2^S大量釋放到細(xì)胞外并進(jìn)入血液循環(huán)中，其血液中含量可達(dá)病毒衣殼粒子的近1000倍。并且在此基礎(chǔ)上改進(jìn)了HEV抗原酶聯(lián)免疫試劑，開發(fā)了膠體金檢測(cè)試劑，有效提高了HEV的檢測(cè)靈敏度和特異性，2018年血清抗原檢測(cè)已被歐洲肝病學(xué)會(huì)列為戊肝診斷的推薦指標(biāo)之一。近期，研究團(tuán)隊(duì)在進(jìn)一步的研究后發(fā)現(xiàn)，患者血液中存在的大量pORF2^S會(huì)特異性聚集到腎臟，并在患者尿液中形成富集，為未來HEV的病原體臨床檢測(cè)指示了更為高效的新靶標(biāo)，同時(shí)還揭示了尿液抗原的主要存在形式及代謝來源。

該研究通過對(duì)急慢性戊肝患者尿液中的HEV pORF2抗原進(jìn)行半定量評(píng)估，發(fā)現(xiàn)在HEV感染者的尿液中存在大量的pORF2抗原，其平均水平甚至達(dá)到了血清抗原平均水平的80倍左右。在病毒復(fù)制期，患者尿液抗原的陽性率達(dá)95.7%，顯著高于血清抗原陽性率（72.3%）及RNA陽性率（70.2%）。對(duì)急性戊肝患者的連續(xù)跟蹤監(jiān)測(cè)還顯示出尿液抗原的檢出率也明顯優(yōu)于血清抗原、血清核酸以及糞便核酸等所有病原體相關(guān)指標(biāo)。動(dòng)物感染模型進(jìn)一步顯示，尿液抗原陽性期與HEV的排毒周期高度一致，在感染早期就可以明顯檢出，并在病毒排毒結(jié)束后同時(shí)陰轉(zhuǎn)，尿液抗原的陽性期比血清抗原及血清RNA均提前了6天。以上結(jié)果明確指示出尿液pORF2抗原是HEV現(xiàn)癥感染的高靈敏度診斷靶標(biāo)。

進(jìn)一步研究顯示，戊肝患者尿液中的pORF2蛋白是單體大小為20 kDa的二聚體蛋白，可鑒定區(qū)域（a.a.453-606）完整包含病毒pORF2蛋白的E2s結(jié)構(gòu)域，并且未檢測(cè)到糖基化修飾。小鼠尾靜脈注射模型進(jìn)一步提示，尿液pORF2抗原的主要來源是血液中的HEV的分泌型蛋白pORF2^S，這是迄今為止明確發(fā)現(xiàn)的唯一能特異性地在無腎臟病理損傷情況下經(jīng)血液進(jìn)入尿液的病原體蛋白。研究發(fā)現(xiàn)pORF2蛋白E2s結(jié)構(gòu)域上以Y485、E572、N573、R578等氨基酸位點(diǎn)構(gòu)成的C6表位區(qū)介導(dǎo)了該蛋白在腎臟的近端腎小管細(xì)胞的特異性富集。這一過程很可能依賴于該類細(xì)胞基底面細(xì)胞膜表面受體引發(fā)的內(nèi)吞及轉(zhuǎn)運(yùn)，最終經(jīng)細(xì)胞頂面分泌進(jìn)入尿液中，抗原在該過程也被進(jìn)一步處理形成尿液中的20kD無糖基化修飾的二聚體形式。

尿液抗原檢測(cè)具有優(yōu)異的靈敏度和特異性，同時(shí)采樣便捷、無創(chuàng)。夏寧邵教授團(tuán)隊(duì)和萬泰生物聯(lián)合研發(fā)的戊肝尿液抗原快速檢測(cè)試劑（Clin Biochem，2018），有望在15分鐘內(nèi)完成檢測(cè)，對(duì)戊肝的臨床檢測(cè)具有重要意義。該試劑目前已提交國家藥監(jiān)局注冊(cè)申請(qǐng)，正處于審批階段。

近日該研究成果以題為“Urine Is a Viral Antigen Reservoir in Hepatitis E Virus Infection”的研究論文在線發(fā)表于Hepatology。該研究是實(shí)驗(yàn)室針對(duì)戊肝病毒pORF2抗原及臨床診斷應(yīng)用系列研究的一部分，也是近年來在JCM（2015）、EMI（2018）、Clin Biochem（2018）和PNAS（2018）上發(fā)表戊肝抗原診斷及戊肝分泌型蛋白等相關(guān)研究論文后的又一項(xiàng)重要研究成果。國家工程中心博士生應(yīng)東，北京大學(xué)博士生何啟瑜，國家工程中心碩士生田瑋琨、碩士生陳燕玲為該論文共同第一作者。國家工程中心夏寧邵教授、鄭子崢副教授，北京大學(xué)王麟副研究員，國家工程中心唐自閩博士后為該論文的共同通訊作者。該研究獲得了國家自然科學(xué)基金和中國科學(xué)技術(shù)協(xié)會(huì)青年人才托舉工程的支持。

論文鏈接：https://aasldpubs.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/hep.32745

來源：廈門大學(xué)