12月2日，《科學》（Science）以Research Article的形式，在線發(fā)表了中國科學院分子細胞科學卓越創(chuàng)新中心（生物化學與細胞生物學研究所）周斌研究組的最新成果（Monitoring of cell-cell communication and contact history in mammals）。該研究基于合成生物學結(jié)合體內(nèi)遺傳學技術(shù)，開發(fā)了可以捕捉體內(nèi)細胞間相互作用并能夠永久追蹤?quán)徑毎膭?chuàng)新研究工具——鄰近細胞遺傳學技術(shù)。利用該技術(shù)，科研人員揭示了心臟內(nèi)皮細胞在早期胚胎發(fā)育過程中遷移到肝臟并轉(zhuǎn)變成為肝血竇內(nèi)皮細胞，以及在腫瘤生長過程中腫瘤血管內(nèi)皮細胞遷移到腫瘤外包膜的現(xiàn)象，這推進了關(guān)于體內(nèi)細胞間相互作用的研究。

細胞之間的交流和相互作用是維持生物體生命活動有序進行的必要條件，解析細胞之間的相互作用對于探索多種生物學過程及調(diào)控機制具有重要意義。近30年來，科學家利用傳統(tǒng)的遺傳示蹤、組織特異性基因敲除或過表達等技術(shù)，只能針對特定細胞自身進行細胞或分子水平的操作，剖析細胞之間的相互作用頗具挑戰(zhàn)。因此，亟需建立新的遺傳操作技術(shù)，實現(xiàn)體內(nèi)監(jiān)測與記錄細胞之間相互作用，為推動細胞生物學、遺傳學及再生醫(yī)學等領(lǐng)域的發(fā)展提供新的強有力工具。

Notch信號通路是細胞之間交流的經(jīng)典信號通路。以往報道將其改造并加入人工調(diào)控元件，用來探究細胞之間的相互作用（Morsut et al., Cell 2016）。在兩個細胞中分別表達人工合成的Notch配體和受體蛋白后，當細胞相互接觸時，受體和配體特異性結(jié)合，引起受體跨膜段的構(gòu)象改變；γ-secretase將切斷受體跨膜段和胞內(nèi)段的連接，釋放胞內(nèi)段的人工合成遺傳元件，如轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Gal4、tTA等，這些遺傳元件可以進入細胞核內(nèi)調(diào)控下游基因的表達。該技術(shù)稱為人工合成Notch信號通路——Synthetic Notch（synNotch）。

周斌研究組長期致力于小鼠體內(nèi)遺傳學技術(shù)的開發(fā)與應(yīng)用。本研究經(jīng)過探索和優(yōu)化，建立了檢測體內(nèi)細胞之間相互作用的新技術(shù)——鄰近細胞遺傳標記技術(shù)。研究以心臟中心肌細胞和內(nèi)皮細胞為例，證明該技術(shù)可在體內(nèi)將細胞接觸信息轉(zhuǎn)變?yōu)檫z傳信號。研究將心肌細胞作為synNotch信號發(fā)送細胞、內(nèi)皮細胞作為synNotch信號接收細胞，分別構(gòu)建了心肌細胞特異性表達synNotch配體的工具小鼠Tnnt2-mGFP，以及內(nèi)皮細胞特異表達synNotch受體的工具小鼠Cdh5-αGFP-N-tTA（Cdh5-GFP nanobody-Notch transmembrane domain-tTA）。在Tnnt2-mGFP;Cdh5-αGFP-N-tTA;tetO-nLacZ小鼠中，當未發(fā)生細胞接觸時，synNotch受體的酶切位點被隱藏在特定蛋白區(qū)域內(nèi)；當細胞相互接觸時，心肌細胞膜表面的GFP蛋白和內(nèi)皮細胞膜表面的GFP抗體特異性結(jié)合，激活synNotch信號通路，受體胞內(nèi)段的tTA進入內(nèi)皮細胞的細胞核中并結(jié)合tetO轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，激活報告基因nLacZ的表達，顯示出與心肌細胞接觸的內(nèi)皮細胞，驗證了該技術(shù)的可行性。為了更加方便熒光成像和細胞分選，研究引入了tetO-tdT熒光報告基因小鼠，更直觀地展現(xiàn)心肌細胞和內(nèi)皮細胞之間的接觸。上述研究證明了鄰近細胞遺傳標記技術(shù)的成功建立。此外，該工作證明這一技術(shù)同樣適用于其他組織中細胞相互作用的研究。

鄰近細胞遺傳標記技術(shù)可以反映細胞之間的實時接觸信息，提升了細胞間相互作用的研究水平和精度。然而，當細胞分開后，synNotch停止激活，細胞膜上的tTA將不再入核；同時，由于蛋白代謝，游離的tTA以及報告蛋白會逐漸減少，受體細胞將很快失去報告蛋白標記。那么，如何實現(xiàn)體內(nèi)鄰近細胞的永久追蹤？

為了使synNotch的瞬時激活轉(zhuǎn)變?yōu)橛谰眯缘倪z傳改變，研究引入了Cre-loxP同源重組系統(tǒng)。當Cre-loxP發(fā)生同源重組后，兩個loxP之間的終止序列被切除，報告基因可以永久性地表達。研究在synNotch技術(shù)中引入tetO-Cre;R26-tdT，實現(xiàn)永久記錄細胞之間的相互作用。與tetO-nLacZ、tetO-tdT類似，tetO-Cre工具小鼠受到tTA的調(diào)控，表達出Cre重組酶。受體和配體細胞相互接觸后激活synNotch信號通路，誘導(dǎo)受體細胞表達Cre，從而使受體細胞被永久示蹤。該技術(shù)稱作鄰近細胞遺傳示蹤技術(shù)。研究以心肌細胞作為配體細胞（Tnnt2-mGFP）、內(nèi)皮細胞作為受體細胞（Cdh5-αGFP-N-tTA），利用該技術(shù)對與心肌細胞接觸過的內(nèi)皮細胞進行永久示蹤。在小鼠胚胎早期，心內(nèi)膜內(nèi)皮細胞與心肌細胞緊密接觸；從胚胎9.0天到出生后，心內(nèi)膜內(nèi)皮細胞來源的房室墊逐漸重塑形成心臟瓣膜，同時，瓣膜中心內(nèi)膜來源的間充質(zhì)細胞不僅遠離心肌細胞，而且不表達Cdh5基因，而研究顯示，這些間充質(zhì)細胞持續(xù)表達tdTomato，證明曾經(jīng)接觸過心肌細胞的內(nèi)皮細胞及其子代細胞都經(jīng)歷過Cre-loxP介導(dǎo)的遺傳操作，被永久性示蹤標記。此外，研究發(fā)現(xiàn)示蹤的心臟內(nèi)皮細胞在早期胚胎發(fā)育過程中會遷移到肝臟，轉(zhuǎn)變成為肝臟特有的肝血竇內(nèi)皮細胞。

細胞間的相互作用還與各種疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。以腫瘤為例，在腫瘤發(fā)生過程中，腫瘤細胞招募周圍組織中的血管遷移至腫瘤，受到腫瘤環(huán)境影響，腫瘤血管與正常血管相比具有顯著差異?？蒲腥藛T利用新開發(fā)的鄰近細胞遺傳學技術(shù)探究腫瘤細胞和內(nèi)皮細胞之間的相互作用。研究將過表達mGFP的TC-1腫瘤細胞系皮下移植到受體小鼠Cdh5-αGFP-N-tTA;tetO-Cre;R26-tdT中。研究觀察到幾乎全部的腫瘤血管內(nèi)皮細胞都被標記上tdTomato，并通過長時程追蹤發(fā)現(xiàn)，腫瘤血管內(nèi)皮細胞會遷移到腫瘤外包膜。這部分遷出腫瘤的血管內(nèi)皮細胞具有典型的轉(zhuǎn)移和浸潤、促血管生成以及炎癥反應(yīng)等特征。上述成果為腫瘤的研究治療奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

基于以上實驗結(jié)果，為了拓展鄰近細胞遺傳學的應(yīng)用范圍，研究人員構(gòu)建了由Cre重組酶誘導(dǎo)表達synNotch配體的小鼠R26-mGFP。搭配特定細胞類型的Cre小鼠品系，通過Cre-LoxP重組，特異性地使該類型細胞表達mGFP，成為配體細胞。同時，科研人員構(gòu)建了由Cre誘導(dǎo)表達synNotch受體的小鼠H11-αGFP-N-tTA，結(jié)合Cre小鼠使特定類型細胞表達αGFP-N-tTA，成為受體細胞。

進一步，研究對該系統(tǒng)進行改造優(yōu)化以提高可用性。研究將序列tetO-rox-stop-rox-tdT-insulator-CAG-loxP-αGFP-N-tTA-pA-loxP-mGFP插入到小鼠基因組Tigre位點，構(gòu)建了Tigre-synNotch小鼠。在該小鼠中，所有細胞都會表達αGFP-N-tTA，成為受體細胞。當搭配特定Cre小鼠時，Cre重組酶會在基因組上切掉αGFP-N-tTA-pA序列，使Cre陽性的細胞表達mGFP，成為配體細胞。所有Cre陰性的細胞保持著受體細胞的狀態(tài)，因此，研究能夠利用Tigre-synNotch標記與特定細胞接觸的所有其他細胞。

綜上，該研究的亮點在于開發(fā)了可以捕捉體內(nèi)細胞間相互作用并能夠永久追蹤?quán)徑毎膭?chuàng)新研究工具——鄰近細胞遺傳學技術(shù)。該技術(shù)具有較高的可調(diào)控性、簡易性和普適性，以全新的視角直觀展現(xiàn)了體內(nèi)細胞間的動態(tài)相互作用。這一新技術(shù)突破了傳統(tǒng)的細胞示蹤方法，將體內(nèi)細胞示蹤和遺傳學研究提升到新的維度，為發(fā)育生物學、干細胞生物學、免疫學和腫瘤學等領(lǐng)域研究提供了新的研究思路和強大技術(shù)支撐。

研究工作得到中科院、國家自然科學基金、科技部、上海市科學技術(shù)委員會，以及分子細胞卓越中心動物平臺和細胞分析技術(shù)平臺等的支持。

　?。╥）小鼠胚胎中心肌細胞表達synNotch配體（綠色），內(nèi)皮細胞表達synNotch受體（紫色）。（ii-iv）新生小鼠心臟中，表達synNocth配體的心肌細胞（綠色，ii），利用鄰近細胞遺傳標記技術(shù)捕捉實時接觸心肌細胞的內(nèi)皮細胞（藍色，iii），利用鄰近細胞遺傳示蹤技術(shù)追蹤接觸過心肌細胞的內(nèi)皮細胞（紅色，iv）。

來源：中科院