2023年4月6日，《Cell Stem Cell》期刊在線發(fā)表了題為《食蟹猴胚胎模型體外培養(yǎng)發(fā)育到原腸胚和引起早期妊娠反應(yīng)》的研究論文，該研究由中國科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心（神經(jīng)科學(xué)研究所）劉真研究組、非人靈長類研究平臺(tái)孫強(qiáng)研究團(tuán)隊(duì)與清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院周帆研究組合作完成。該研究利用胚胎干細(xì)胞建立了食蟹猴類囊胚誘導(dǎo)系統(tǒng)，體外培養(yǎng)食蟹猴類囊胚可誘導(dǎo)原腸運(yùn)動(dòng)的相關(guān)胚層，體內(nèi)移植可以檢測到早期妊娠囊的出現(xiàn)。

胚胎著床至原腸運(yùn)動(dòng)是發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期，也是臨床上早期流產(chǎn)的高發(fā)期。相較于嚙齒類模式動(dòng)物，靈長類著床至原腸運(yùn)動(dòng)時(shí)期的研究嚴(yán)重滯后。基于胚胎干細(xì)胞組裝的類胚胎研究為靈長類早期著床發(fā)育提供了新的途徑。目前小鼠胚胎干細(xì)胞來源的類胚胎能體外培養(yǎng)到神經(jīng)發(fā)生和器官發(fā)生階段，人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)獲得的類囊胚也可以模擬囊胚階段的形態(tài)和分子特征。

非人靈長類擁有與人更為相近的生殖發(fā)育和胚胎發(fā)育特點(diǎn)，是研究人類生殖和胚胎發(fā)育的理想動(dòng)物模型。研究團(tuán)隊(duì)創(chuàng)新性地用非人靈長類胚胎干細(xì)胞代替人多能干細(xì)胞，進(jìn)行食蟹猴類囊胚體外誘導(dǎo)。研究人員通過比較不同培養(yǎng)狀態(tài)的食蟹猴胚胎干細(xì)胞以及優(yōu)化體外誘導(dǎo)體系和方法，高效得到了形態(tài)上和食蟹猴囊胚非常接近的類囊胚。結(jié)合單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序與分析、三個(gè)譜系干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)，以及其他一系列分子細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明食蟹猴類囊胚在主要細(xì)胞譜系組成以及相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組水平等和正常囊胚相似（圖1A-B）。為了研究其體外發(fā)育潛能，研究人員對食蟹猴類囊胚進(jìn)行了長時(shí)程體外延遲培養(yǎng)。

當(dāng)體外培養(yǎng)至D15，類囊胚發(fā)育至早期著床的雙層胚盤狀結(jié)構(gòu)，包括典型的OCT4+的EPI樣外胚層結(jié)構(gòu)和明顯的羊膜腔以及GATA6+的卵黃囊腔（圖1C）。研究人員進(jìn)一步培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)至D17，前面出現(xiàn)的雙層胚盤樣結(jié)構(gòu)的食蟹猴類胚胎中會(huì)有一小部分繼續(xù)發(fā)育，形成圓盤樣結(jié)構(gòu)，并包含前后軸、原條，絨毛膜腔等特征性細(xì)胞群體，且部分形態(tài)與之前報(bào)道的人類CS7（E16-19）時(shí)期的體內(nèi)原腸胚相似（圖1D）。免疫熒光染色結(jié)果進(jìn)一步展示了其形態(tài)特征（圖1E）。結(jié)合測序數(shù)據(jù)的挖掘和對比分析，作者發(fā)現(xiàn)D17食蟹猴類胚胎具有上胚層細(xì)胞（EPI）, 原條細(xì)胞（gastrulating cells）, 原始生殖細(xì)胞（PGCs）, 羊膜上皮細(xì)胞（AME）, 胚外中胚層細(xì)胞（EXMC）, 滋養(yǎng)層細(xì)胞（TE）, 內(nèi)臟內(nèi)胚層/卵黃囊內(nèi)胚層細(xì)胞（VE/YE）等。此外，D17食蟹猴類胚胎中還檢測到了原始造血相關(guān)細(xì)胞，包括造血內(nèi)皮細(xì)胞 (HECs), 造血內(nèi)皮祖細(xì)胞 (HEPs)以及幼紅細(xì)胞(Ery)。這意味著D17食蟹猴類胚胎已經(jīng)進(jìn)入三胚層分化階段。

研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步分析鑒定發(fā)現(xiàn)D17食蟹猴類胚胎還具有胚胎非神經(jīng)外胚層（NNE）、新生中胚層（NM），晚期中胚層（AM）、定型內(nèi)胚層（DE）等三胚層類似的細(xì)胞群體（圖1F）。該研究揭示了D17食蟹猴類胚胎無論從形態(tài)還是細(xì)胞譜系組成上都與之前報(bào)道的人的CS7（E16-19）時(shí)期的體內(nèi)原腸胚相似，提示誘導(dǎo)的類囊胚具有模擬著床后發(fā)育的能力。研究團(tuán)隊(duì)將該發(fā)育潛能的食蟹猴類囊胚進(jìn)行同種體內(nèi)移植，進(jìn)一步檢測其體內(nèi)發(fā)育潛力。結(jié)果顯示，3/8受體在移植后能檢測到明顯的著床點(diǎn)和早期妊娠囊的出現(xiàn)，同時(shí)伴隨血清中絨毛膜促性腺激素和孕激素水平的提高（圖2）。

該研究利用胚胎干細(xì)胞體外重構(gòu)了非人靈長類類囊胚，并對其體內(nèi)外發(fā)育潛能進(jìn)行深入全面的探究和評(píng)估，首次將非人靈長類的類囊胚體外培養(yǎng)至著床后原腸胚時(shí)期。

中科院腦智卓越中心博士后李杰，清華大學(xué)周帆課題組科研助理朱慶元，中科院腦智卓越中心與西北農(nóng)林科技大學(xué)聯(lián)合培養(yǎng)博士生曹靜，清華大學(xué)2021級(jí)博士生劉瑩、中科院腦智卓越中心非人靈長類研究平臺(tái)實(shí)驗(yàn)師陸勇為該論文共同第一作者。中科院腦智卓越中心孫怡迪研究員、孫怡寧、黃奕銘、尚申申、卞新顏、李春楊、張連升博士、王燕、聶艷紅、傅吉強(qiáng)博士，清華大學(xué)2021級(jí)博士生李倩，中科院廣州健康院Miguel A. Esteban研究員、李文娟博士、Md. Abdul Mazid博士、姜禹、賈雯淇，西北農(nóng)林科技大學(xué)王曉龍研究員為本研究提供了重要幫助。該研究得到科技部、中科院、上海市、基金委和臨港實(shí)驗(yàn)室的資助。

圖1.（A）非人靈長類食蟹猴類囊胚體外重構(gòu)。（B）scRNA-seq分析體外重構(gòu)的非人靈長類食蟹猴類囊胚的細(xì)胞譜系構(gòu)成。（C）非人靈長類食蟹猴類囊胚體外延遲培養(yǎng)至D15時(shí)形成的雙層胚盤樣結(jié)構(gòu)。（D）非人靈長類食蟹猴類囊胚體外延遲培養(yǎng)至D17時(shí)形成的原腸胚樣結(jié)構(gòu)。（E）非人靈長類食蟹猴D17類胚胎的形態(tài)學(xué)染色。OCT4, EPI marker. GATA6, amine marker. T(Brachyury), gastrulation marker. （F）非人靈長類食蟹猴D17類胚胎的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析和發(fā)育路徑分析。

圖2.?非人靈長類類囊胚體外重構(gòu)和體內(nèi)外發(fā)育潛能研究模式圖。

來源：中國科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心