近日，北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心、昌平實(shí)驗(yàn)室郭強(qiáng)研究員課題組在Journal of Structural Biology發(fā)表了題為“A practical multicellular sample preparation pipeline broadens the application of in situ cryo-electron tomography”的研究論文。在本項(xiàng)工作中，研究者提出了一種適用于多細(xì)胞樣品冷凍電鏡原位結(jié)構(gòu)研究的實(shí)用流程，該流程包括樣品分離（圖1a）、冷凍樣品制備（圖1b），以及原位lift-out減薄（圖1c）。

圖1. 多細(xì)胞冷凍電子斷層掃描樣品制備流程示意圖

該方法通過改進(jìn)冷凍樣品制備方法，使得樣品能夠完整且迅速地從冷凍填充劑中暴露出來（圖1e），避免了傳統(tǒng)冷凍保護(hù)劑所引入的樣品定位難題（圖1d），從而大大縮短了樣品準(zhǔn)備時(shí)間；通過優(yōu)化lift-out樣品減薄流程，在極大縮短樣品減薄時(shí)間的同時(shí)大幅度提升成功率；通過設(shè)計(jì)新型電鏡載網(wǎng)為薄片提供更好的機(jī)械支撐，最終可以獲得穩(wěn)定的較大薄區(qū)（圖1f, 1g）。此研究為組織等多細(xì)胞樣品的冷凍電鏡原位結(jié)構(gòu)研究提供了一種流程更簡單、耗時(shí)更短、成功率更高的新方案。

采用此方法，研究者對小鼠胰島進(jìn)行冷凍電鏡原位結(jié)構(gòu)觀察，首次實(shí)現(xiàn)了β細(xì)胞胰島素晶體的原位分析（圖2）。研究者觀察到三種不同類型的囊泡，分別為棒狀晶體囊泡（圖2h），未成熟胰島素晶體囊泡（圖2i）以及成熟的胰島素晶體囊泡（圖2j），并對囊泡的數(shù)量與位置分布進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)（圖2a，2k）。分析結(jié)果表明，成熟的胰島素晶體囊泡占97%，且不同類型的胰島素囊泡分布無明顯特征。而此前使用單細(xì)胞體系研究發(fā)現(xiàn)，不同成熟狀態(tài)的胰島素囊泡呈現(xiàn)有組織的空間分布，說明了組織等多細(xì)胞原位結(jié)構(gòu)研究的必要性。

圖2. 胰島β細(xì)胞的原位結(jié)構(gòu)

通過對此流程所收集的數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析（圖3），研究者原位確定了胰島素的晶胞參數(shù)（圖3c—f）。其與體外觀察到的六方晶體的結(jié)構(gòu)差異則表明細(xì)胞內(nèi)生理?xiàng)l件對晶體堆積的潛在影響。

圖3. 胰島素晶體原位晶胞參數(shù)測定

郭強(qiáng)為本文的通訊作者。郭強(qiáng)課題組博士生吳伊春、北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院秦昌東博士、郭強(qiáng)課題組技術(shù)員杜文靜為本文的共同第一作者，北京大學(xué)陳良怡教授和郭振璽博士為該工作作出了重要貢獻(xiàn)。本工作中的樣品制備與數(shù)據(jù)收集在北京大學(xué)冷凍電鏡平臺完成，數(shù)據(jù)處理獲得了北京大學(xué)未名超算平臺的硬件和技術(shù)支持。該研究得到了科技部重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心、生命科學(xué)學(xué)院、SLS-啟東創(chuàng)新基金、蛋白質(zhì)與植物基因研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室以及昌平實(shí)驗(yàn)室的經(jīng)費(fèi)支持。

來源：北京大學(xué)