CRISPR-Cas技術(shù)促進(jìn)生物醫(yī)學(xué)研究。除了廣泛使用的Cas9系統(tǒng)之外，其他CRISPR亞型也不斷被發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于基因編輯，例如能夠裝載進(jìn)AAV病毒的SaCas9（1053 aa）以及更小的微型CRISPR-Cas系統(tǒng)Cas12f（400~550 aa）。已發(fā)表的工作重建了CRISPR-Cas系統(tǒng)的起源，發(fā)現(xiàn)了原核轉(zhuǎn)座子編碼的IscB和TnpB蛋白分別是Cas9與Cas12核酸酶的祖先。這些祖先蛋白尺寸較小，但是否具備核酸酶活性缺乏證據(jù)；直到2021年，IscB和TnpB被發(fā)現(xiàn)在非編碼RNA（omegaRNA或reRNA）引導(dǎo)下切割雙鏈DNA，證實了其與CRISPR-Cas系統(tǒng)相似的工作機(jī)制。TnpB由IS200/IS605等原核轉(zhuǎn)座子家族編碼，并被推測參與轉(zhuǎn)座子的擴(kuò)張。TnpB的分布非常廣泛，在目前已知的基因組存在超過百萬的拷貝；而此前研究只發(fā)現(xiàn)了一種在人類細(xì)胞中具有活性的TnpB核酸酶（ISDra2），且效率不高；因此，TnpB這一有潛力作為微型編輯工具的多樣性寶庫急需系統(tǒng)性的挖掘和研究。同時，由于可能推動轉(zhuǎn)座子擴(kuò)張，TnpB靶向切割DNA所依賴的關(guān)鍵元件（如reRNA）與轉(zhuǎn)座子或存在關(guān)聯(lián)，因而可以基于轉(zhuǎn)座子信息進(jìn)行預(yù)測，這將為工具的開發(fā)提供便利。

6月29日，中國科學(xué)院動物研究所/北京干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)研究院研究員王皓毅、博士項光海和動物所研究員張勇團(tuán)隊合作，在《自然-生物技術(shù)》（Nature Biotechnology）上，在線發(fā)表了題為Evolutionary mining and functional characterization of TnpB nucleases identify efficient miniature genome editors的研究論文?！蹲匀?生物技術(shù)》同時發(fā)表了Research Briefing文章，對該成果進(jìn)行總結(jié)和展望（Hypercompact genome editors are discovered by mining a transposon family）。該研究創(chuàng)新性地建立了對TnpB相關(guān)靶向基因編輯系統(tǒng)的大規(guī)模挖掘方法，并首次對多樣性極其豐富的TnpB核酸酶進(jìn)行了大規(guī)模挖掘，從而鑒定到33個在原核系統(tǒng)具有靶向編輯活性的TnpB蛋白，其中5個在真核系統(tǒng)具有活性。

研究對ISfinder原核轉(zhuǎn)座子數(shù)據(jù)庫中IS605編碼的TnpB蛋白進(jìn)行了全面的分析和挖掘，從64個候選項中鑒定出25種在大腸桿菌中活躍的系統(tǒng)，其中3種在人類細(xì)胞中具有基因編輯活性。該工作對功能數(shù)據(jù)的進(jìn)一步分析揭示了TnpB蛋白相關(guān)的reRNA骨架與IS200/IS605轉(zhuǎn)座子的RE序列具有完全重疊的3’末端，而TAM序列則與轉(zhuǎn)座子上游的插入位點序列相同。研究表明，在TnpB系統(tǒng)中，與RNA介導(dǎo)的編輯器相關(guān)的三大要素（核酸酶、gRNA骨架和TAM序列）均可通過生物信息分析準(zhǔn)確預(yù)測，這為大規(guī)模篩選高活性TnpB核酸酶奠定了基礎(chǔ)。這一發(fā)現(xiàn)同時進(jìn)一步確定了TnpB在IS605中的功能，即作為歸巢核酸酶切割轉(zhuǎn)座之后的原位點，從而誘導(dǎo)重組修復(fù)實現(xiàn)轉(zhuǎn)座子的拷貝數(shù)擴(kuò)增。

進(jìn)一步，該團(tuán)隊從4個方面對TnpB相關(guān)的reRNA骨架進(jìn)行了分析。結(jié)果表明：reRNA骨架在120-300nt的長度范圍內(nèi)均能夠有效發(fā)揮功能，而120-140nt的reRNA骨架活性最強(qiáng)；reRNA骨架在3’末端的堿基對其功能有重要影響，單一堿基的突變即會顯著降低編輯活性；靶向序列的長度在16-20nt為最佳；靠近TAM端的12nt是TnpB編輯器的核心序列。研究進(jìn)一步整合分析了影響TnpB編輯器活性的潛在因素，發(fā)現(xiàn)了來自細(xì)菌的、由多拷貝轉(zhuǎn)座子編碼的、具有完整蛋白結(jié)構(gòu)域和保守氨基酸的TnpB編輯器更為活躍。

該團(tuán)隊基于上述研究，建立了大規(guī)模挖掘全新TnpB基因編輯器的方法（如圖），對部分未經(jīng)轉(zhuǎn)座子注釋的原核基因組進(jìn)行了從頭注釋和功能預(yù)測，并直接在人類細(xì)胞系中篩選獲得了新的微型高活性TnpB編輯器ISAam1（369 aa）和ISYmu1（382 aa）。與其他微型Cas蛋白的平行比較發(fā)現(xiàn)，ISAam1和ISYmu1的活性與SaCas9相當(dāng)，顯著高于數(shù)種已報道的Cas12f蛋白及其變體。

綜上，該研究建立了適用于TnpB編輯器的大規(guī)模篩選體系，進(jìn)一步證明了TnpB在轉(zhuǎn)座子擴(kuò)張中的功能，并對這一類編輯器進(jìn)行了系統(tǒng)的功能解析，從而獲得了目前最小的具備原創(chuàng)知識產(chǎn)權(quán)的微型基因編輯器?？紤]到體內(nèi)基因治療和細(xì)胞治療經(jīng)常因Cas蛋白過大而遞送受限，這一成果將推動相關(guān)方面的研究和臨床應(yīng)用。

王皓毅致力于新型基因編輯工具的開發(fā)及CAR-T細(xì)胞治療研究；張勇致力于轉(zhuǎn)座子等機(jī)制介導(dǎo)的新重復(fù)基因的起源和進(jìn)化研究。兩個團(tuán)隊的合作推動了對TnpB的挖掘。研究工作得到科學(xué)技術(shù)部、中國科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部和國家自然科學(xué)基金委員會等的支持。

動物所開發(fā)出新型TnpB微型基因編輯工具

來源：中科院