基因組編輯可以對生物體遺傳信息進(jìn)行精準(zhǔn)、高效的修飾，已成為生命科學(xué)領(lǐng)域的一項顛覆性技術(shù)。通過融合nCas9（切口酶形式的Cas9）與脫氨酶，美國哈佛大學(xué)David Liu團(tuán)隊先后開發(fā)出胞嘧啶堿基編輯系統(tǒng)（Cytosine base editor，CBE）和腺嘌呤堿基編輯系統(tǒng)（Adenine base editor，ABE），將以CRISPR為代表的基因組編輯技術(shù)引入了“精準(zhǔn)編輯”的全新時代。

近日，中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所高彩霞團(tuán)隊開發(fā)了突破CRISPR限制的模塊化結(jié)構(gòu)的堿基編輯新系統(tǒng)——CyDENT。與此前的堿基編輯工具不同，這一系統(tǒng)在細(xì)胞核、線粒體和葉綠體中均實現(xiàn)了高效胞嘧啶堿基編輯，尤其是在線粒體編輯中展現(xiàn)出優(yōu)良的鏈特異性和低序列偏好性，提供了具有廣泛基因組靶向能力且高精準(zhǔn)的全新堿基編輯工具。

CyDENT系統(tǒng)包含TALE蛋白、FokI切口酶、單鏈特異性胞嘧啶脫氨酶、DNA外切酶及UGI等組分，并基于一套全新的工作模型：首先由TALE蛋白引導(dǎo)FokI切口酶至細(xì)胞核或者細(xì)胞器的DNA靶點處產(chǎn)生單鏈切口，之后由DNA外切酶從切口處對包含切口的DNA鏈進(jìn)行部分外切消化，此時互補鏈將以單鏈DNA的形式呈現(xiàn)，成為單鏈特異性胞嘧啶脫氨酶的作用底物，并在UGI的幫助下最終完成胞嘧啶堿基編輯。由于能夠發(fā)生脫氨的DNA鏈取決于切口產(chǎn)生的位置，該工作模型能夠?qū)崿F(xiàn)具有單鏈偏好性的堿基編輯，提高了編輯精準(zhǔn)度。

研究分別選取水稻原生質(zhì)體細(xì)胞核、葉綠體以及HEK293T細(xì)胞系線粒體中的靶點進(jìn)行測試。結(jié)果顯示：CyDENT均可實現(xiàn)高效的胞嘧啶堿基編輯，其中在動物細(xì)胞線粒體中的編輯效率接近40%；CyDENT系統(tǒng)可進(jìn)行具有單鏈偏好性的線粒體堿基編輯，精準(zhǔn)性相較于基于雙鏈脫氨原理的線粒體堿基編輯器得到了提升。此外，得益于CyDENT系統(tǒng)的模塊化特性，研究還將該團(tuán)隊近期利用AI輔助挖掘得到的全新脫氨酶（DOI: 10.1016/j.cell.2023.05.041）與其結(jié)合，對處于不同序列背景（TC或GC）下的胞嘧啶進(jìn)行有效編輯，提升了堿基編輯的精準(zhǔn)性和靈活性。通過將胞嘧啶脫氨酶更換為腺嘌呤脫氨酶，CyDENT還具有進(jìn)行腺嘌呤堿基編輯的潛力。通過全核基因組和全線粒體基因組脫靶分析表明了CyDENT具有良好的編輯特異性。

總的來說，具有完全自主知識產(chǎn)權(quán)的不依賴CRISPR的全新堿基編輯工具CyDENT，首次集成了對細(xì)胞核和細(xì)胞器進(jìn)行精準(zhǔn)堿基編輯的能力。結(jié)合該團(tuán)隊前期挖掘的全新脫氨酶，本研究進(jìn)一步實現(xiàn)了CyDENT系統(tǒng)從核心組分到底層工作模型的全自主創(chuàng)新。CyDENT系統(tǒng)的開發(fā)，再次升級了細(xì)胞核及細(xì)胞器的精準(zhǔn)編輯策略，對疾病治療和農(nóng)作物精準(zhǔn)分子育種具有重要的潛在應(yīng)用價值。

8月28日，相關(guān)研究成果以Strand-preferred base editing of organellar and nuclear genomes using CyDENT為題，在線發(fā)表在《自然-生物技術(shù)》（Nature Biotechnology，DOI : 10.1038/s41587-023-01910-9）上。研究工作得到農(nóng)業(yè)農(nóng)村部、中國科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項、國家重點研發(fā)計劃和國家自然科學(xué)基金等的支持。

CyDENT堿基編輯系統(tǒng)及其應(yīng)用。a、CyDENT堿基編輯工作模型及在細(xì)胞核和細(xì)胞器編輯中的應(yīng)用；b、CyDENT在植物細(xì)胞核中的單鏈特異性堿基編輯；c、CyDENT在動物細(xì)胞線粒體中的單鏈特異性堿基編輯。

來源： 遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所