對絕大多數(shù)動物而言，睡眠不可或缺。人類一生要花費約1/3的時間用于睡眠，而睡眠不足會導致多種健康問題，例如引發(fā)炎癥或慢性免疫系統(tǒng)疾病。動物實驗表明，長時間睡眠剝奪會導致其個體死亡。然而，哺乳動物的睡眠如何調控免疫系統(tǒng)，睡眠不足又如何帶來負面的健康影響，其機制尚未厘清。

2023年11月27日，北京生命科學研究所/清華大學生物醫(yī)學交叉研究院張二荃實驗室在Cell上在線發(fā)表了題為Prolonged sleep deprivation induces a cytokine storm-like syndrome in mammals的研究論文。該研究發(fā)現(xiàn)小鼠長時間睡眠剝奪將導致嚴重細胞因子風暴，并且揭示了睡眠剝奪導致外周免疫反應的神經(jīng)分子機制——腦源PGD₂/DP1信號通路。

在此研究課題中，張二荃實驗室研究人員首創(chuàng)了一套適用于小鼠的定名為“Curling Prevention by Water”（CPW）的睡眠剝奪系統(tǒng)（圖一），通過腦電圖/肌電圖（EEG/EMG）記錄實驗組小鼠和對照組小鼠的睡眠/覺醒情況，確認該系統(tǒng)可以持續(xù)剝奪小鼠95%以上的睡眠。該系統(tǒng)相較于傳統(tǒng)的實驗動物轉桿睡眠剝奪系統(tǒng)（Stand Alone Sleep Deprivation，SASD），可以在不引入更多環(huán)境刺激和保證實驗通量的基礎上極大提高睡眠剝奪效率，從而幫助研究人員可以觀察到長時間睡眠剝奪后對哺乳動物帶來的生理后果。

圖一 Curling Prevention by Water睡眠剝奪系統(tǒng)

哈佛醫(yī)學院的Rogulja實驗室于2020年在Cell上發(fā)表以果蠅為研究對象，研究睡眠剝奪對動物產(chǎn)生的生理后果。他們發(fā)現(xiàn)睡眠剝奪的果蠅在腸道中積累了大量活性氧（ROS），從而顯著縮短了睡眠剝奪果蠅的壽命。盡管他們也在睡眠剝奪的小鼠中發(fā)現(xiàn)，其腸道ROS含量相較于對照組小鼠顯著上升，但并未發(fā)現(xiàn)睡眠剝奪會導致小鼠死亡，因而高等的如哺乳動物中是否存在類似的現(xiàn)象、其可能的作用機制仍不明確。

本實驗中，張二荃實驗室研究人員發(fā)現(xiàn)小鼠腸道ROS的積累與小鼠在睡眠剝奪后免疫反應強度相關，這說明了ROS產(chǎn)生在免疫激活反應的下游，而非上游；更重要的是，為小鼠提供N-乙酰半胱氨酸（NAC）和硫辛酸（lipoic acid）等抗氧化劑，并不能緩解小鼠睡眠剝奪致死的現(xiàn)象，這些都說明不能把果蠅睡眠剝奪致死的機制簡單地推廣到小鼠：雖然哺乳動物中長時間完全地睡眠剝奪也會致死，但致死原因與腸道ROS積累無關（既非充分也非必要條件）。

研究人員應用CPW系統(tǒng)對小鼠進行長時間睡眠剝奪時發(fā)現(xiàn)，對小鼠進行4天連續(xù)睡眠剝奪后，高達70%以上小鼠會死于嚴重的多器官衰竭。在睡眠剝奪過程中，小鼠血液中的促炎性的細胞因子（如IL-6和IL-17A）和趨化因子（如CXCL1和CXCL2）迅速積累，并將中性粒細胞從骨髓招募到循環(huán)系統(tǒng)中，從而導致小鼠出現(xiàn)中性粒細胞增多癥。隨著促炎性的細胞因子與趨化因子的持續(xù)性積累，小鼠出現(xiàn)由細胞因子風暴誘發(fā)的多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysregulation syndrome，MODS），最終導致小鼠的死亡。

睡眠不足導致的炎癥反應，一般都會被解釋為免疫力下降，進而招致的外界細菌或病毒感染。但為了厘清到底是免疫能力減弱，還是反過來的免疫反應過強導致的個體死亡，研究人員做了以下實驗：一是在睡眠剝奪過程中，為小鼠提供抗細胞因子風暴藥物能夠緩和睡眠剝奪導致的免疫反應并延長小鼠的存活時間。二是將野生型小鼠替換為免疫缺陷品系（M-NSG）小鼠。如果是因為免疫力弱而由外界病原體感染導致死亡的話，M-NSG小鼠預期應該會更快地死亡。但事實上，對這種小鼠進行長達一周的睡眠剝奪都不會有個體死亡。

以上實驗說明了不睡覺導致的死亡真正原因是免疫系統(tǒng)的過度激活（這與引發(fā)人體新冠重癥的“細胞因子風暴”類似）。

除此之外，為了研究睡眠剝奪如何調控免疫反應，研究人員首先探究睡眠剝奪如何影響大腦神經(jīng)系統(tǒng)的功能。研究人員發(fā)現(xiàn)睡眠剝奪導致的免疫反應并非通過大腦向外周的直接神經(jīng)投射進行調控，而是通過大腦產(chǎn)生的特定分子釋放到外周循環(huán)系統(tǒng)進而誘發(fā)的。睡眠剝奪后，小鼠的血腦屏障的主動外排（active efflux）活動持續(xù)顯著增強。血腦屏障的主動外排活動由ABC轉運受體介導，而這其中，通過藥物和抑制ABCC家族轉運受體能夠緩和睡眠剝奪小鼠體內的免疫反應并且延長睡眠剝奪小鼠的存活時間。因而，研究人員推斷睡眠剝奪導致的免疫反應由ABCC轉運受體的某種底物介導；在睡眠剝奪過程中，隨著血腦屏障主動外排活動從大腦轉運到外周，進而引起免疫反應。

應用北京大學李毓龍實驗室最新開發(fā)的GRAB（GPCR activation-based）探針，研究人員發(fā)現(xiàn)，睡眠剝奪后PGD₂（前列腺素D2）在大腦內積累顯著增加。同時，研究人員還應用UPLC-MS質譜檢測到循環(huán)系統(tǒng)中PGD₂相對穩(wěn)定的代謝物Tetranor-PGDM含量也顯著增加。為進一步驗證PGD₂在睡眠剝奪后的轉運情況，研究人員使用³H標記的PGD₂進行了小鼠活體血腦屏障主動外排指數(shù)BEI（BBB Efflux Index）檢測，發(fā)現(xiàn)睡眠剝奪后PGD₂轉運到外周循環(huán)系統(tǒng)的速度明顯提高。

研究人員使用遺傳學手段驗證PGD₂在睡眠剝奪導致的免疫反應中發(fā)揮的核心作用：分別對腦內PGD₂合成酶（包括全身敲除的Ptgds^-/-、和應用腦內嵌合基因敲除技術獲得的Ptgds^BKO），以及將由腦內PGD₂ efflux出來的特異性轉運受體Abcc4^-/-小鼠，進行睡眠剝奪，發(fā)現(xiàn)這些遺傳突變鼠都能夠顯著降低誘發(fā)的炎癥反應和延長小鼠存活時間。最后，研究人員發(fā)現(xiàn)靜脈注射PGD₂受體（DP1）激動劑能夠誘發(fā)正常小鼠出現(xiàn)與睡眠剝奪小鼠類似的中性粒細胞增多癥；同時，在睡眠剝奪過程中，如果為小鼠提供DP1拮抗劑，則能顯著緩和小鼠因睡眠剝奪導致的炎癥反應。這些結果也印證了睡眠剝奪導致的免疫激活反應依賴于從腦源的PGD₂到外周器官DP1的信號通路（圖二）。

該研究不僅為解釋和解決睡眠不足導致的健康問題奠定了基礎，而且有助于深入理解睡眠如何與其他生物學過程相互作用，從而進一步闡釋睡眠的功能與意義。

圖二 睡眠剝奪導致細胞因子風暴的通路模型

張二荃實驗室的桑迪、林可騰，以及北京大學李毓龍實驗室的楊旖旎為本文的共同第一作者，張二荃博士為通訊作者。其他作者還包括張二荃實驗室的冉光地和陳晨，李毓龍實驗室的李柏翰，羅敏敏實驗室已畢業(yè)博士生盧立輝，他們在各項實驗操作中做出了重要貢獻；北京生命科學研究所的劉清華博士、李祺博士、馬燕博士，北京大學李毓龍博士、劉志博博士、崔希洋博士，北京腦科學與類腦研究所的羅敏敏博士，新橋醫(yī)院的呂勝青博士等也參與了此項課題。

本課題的研究經(jīng)費受中國科技部、國家自然科學基金委、北京市政府和清華大學支持。

相關論文信息：https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.10.025

來源：《細胞》