近年來，基因編輯領(lǐng)域的一些研究人員開始關(guān)注開發(fā)不受CRISPR-Cas9系統(tǒng)限制的工具，因為這個系統(tǒng)存在準(zhǔn)確性和其他安全性方面的疑慮。

最近開發(fā)的一個工具是原位編輯系統(tǒng)，它是由兩個組成部分組成的分子復(fù)合物：原位編輯酶和原位編輯guide RNA（pegRNA）。原位編輯酶結(jié)合了SpCas9蛋白和逆轉(zhuǎn)錄酶，pegRNA是經(jīng)過改造的導(dǎo)向RNA，它識別DNA中的目標(biāo)序列并編碼所需的編輯。

原位編輯已經(jīng)成功應(yīng)用于植物、斑馬魚和小鼠的活體細(xì)胞中。然而，由于缺乏結(jié)構(gòu)信息，原位編輯通過pegRNA引導(dǎo)的逆轉(zhuǎn)錄的分子機(jī)制仍然不太清楚。

現(xiàn)在，東京大學(xué)的研究人員利用冷凍電子顯微鏡確定了SpCas9-M-MLV RTΔRNaseH-pegRNA-靶向DNA復(fù)合物在多個狀態(tài)下的空間結(jié)構(gòu)。

東京大學(xué)生物科學(xué)系的Yutaro Shuto博士解釋說：“我們發(fā)現(xiàn)原位編輯復(fù)合物在實驗條件下不穩(wěn)定，所以優(yōu)化復(fù)合物保持穩(wěn)定的條件是非常具有挑戰(zhàn)性的。很長一段時間，我們只能確定Cas9的結(jié)構(gòu)?！?/p>

基于這些結(jié)構(gòu)的功能分析還揭示了原位編輯器如何在不切割DNA雙螺旋的兩條鏈的情況下實現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄。闡明這些分子機(jī)制對于設(shè)計足夠準(zhǔn)確的基因編輯工具以進(jìn)行基因療法非常重要。

研究人員成功確定了在靶向DNA上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄過程中的原位編輯復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)的多個狀態(tài)。結(jié)構(gòu)顯示逆轉(zhuǎn)錄酶結(jié)合到與DNA切割相關(guān)的Cas9蛋白的一部分，即雙螺旋的單鏈分離。

在進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄過程中，逆轉(zhuǎn)錄酶相對于Cas9蛋白保持其位置不變。結(jié)構(gòu)和生物化學(xué)分析還表明，逆轉(zhuǎn)錄酶可能會導(dǎo)致額外的、不希望的插入。

具體來說，作者寫道：“終止結(jié)構(gòu)以及我們的功能分析揭示了M-MLV RT在預(yù)期位點之外延伸逆轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致腳手架來源的插入，從而在目標(biāo)位點引起不希望的編輯。此外，對于起始、初始化和延伸狀態(tài)之間的結(jié)構(gòu)比較顯示，M-MLV RT在逆轉(zhuǎn)錄過程中與SpCas9保持一致的位置，而pegRNA合成的DNA異二聚體沿著SpCas9的表面積累?！?/p>

Shuto解釋說：“我們在這項研究中的結(jié)構(gòu)確定策略也可以應(yīng)用于由不同Cas9蛋白和逆轉(zhuǎn)錄酶組成的原位編輯器。我們希望利用新獲得的結(jié)構(gòu)信息來推動改進(jìn)原位編輯器的發(fā)展?！?/p>

參考文獻(xiàn)：https://www.nature.com/articles/s41586-024-07497-8

編輯：王洪

排版：李麗