杜克大學生物醫(yī)學工程科學家研發(fā)出一種新方法，可以將CRISPR基因組編輯技術的準確性平均提高50倍，他們相信這種技術將能很快應用到多種編輯技術上。

具體來說，這種方法就是在導向RNA上添加一段短“尾巴”，這種“尾巴”會向后折疊，與其自身結合，形成一個“發(fā)夾”結構，只有靶向DNA序列能解開。

這一研究成果公布在4月15日的Nature Biotechnology雜志上。

多個CRISPR系統(tǒng)都會產(chǎn)生不必要的遺傳編輯

“一般來說，CRISPR準確性高，但已經(jīng)有了一些例子出現(xiàn)了脫靶效應，因此這個研究領域對于提高特異性普遍關注。但到目前為止提出的解決方案都不能在不同的CRISPR系統(tǒng)之間輕松轉換”，文章作者，杜克大學生物醫(yī)學工程副教授Charles Gersbach說。

CRISPR-Cas9是一種防御系統(tǒng)，細菌用它來靶向和切割入侵病毒的DNA。雖然第一個被設計用于人體細胞的CRISPR技術源自Streptococcus pyogenes這種細菌，但其它細菌也具有其它的形式。

一直以來，科學家們花費了大量時間，找到了特殊的新CRISPR系統(tǒng)，不斷添加到CRISPR庫中。例如，一些系統(tǒng)較小，適合病毒載體遞送至人體細胞用于基因治療。但無論這些系統(tǒng)的功能如何，都會產(chǎn)生不必要的遺傳編輯。

CRISPR系統(tǒng)的一個共同特性是利用RNA分子作為指導，一旦導向RNA找到其互補的基因序列，Cas9酶就像剪刀一樣在DNA中切割，促進基因組序列的改變。但是因為每個序列只有20個核苷酸長，而人類基因組含有大約30億個堿基對，所以搜尋過程漫長，而且CRISPR有時會出現(xiàn)錯誤，對上了錯誤的堿基對。

提高CRISPR準確性的一種方法是兩個Cas9分子結合到相同DNA序列的相對鏈上，完成完全切割。雖然這種方法有效，但它會給系統(tǒng)增加更多部件，增加復雜性，難以實現(xiàn)。

另一種方法是對Cas9蛋白進行基因工程改造，使其功效降低，從而更少的犯錯誤，但是要構建這樣的蛋白并不容易，同時對于不同的CRISPR系統(tǒng)，需要不同的蛋白工程設計。

導向RNA的設計

“現(xiàn)在似乎每周都會發(fā)現(xiàn)一種新的CRISPR系統(tǒng)，它們具有獨特的性質，在特定的應用中非常有效，”Gersbach說，“每當我們發(fā)現(xiàn)新的CRISPR蛋白，進行廣泛的重新設計并不是一個容易實現(xiàn)的解決方法?！?/p>

“我們希望能研發(fā)出對于任何類型的CRISPR系統(tǒng)都是通用的方法，”博士生Dewran Kocak說，“所有CRISPR系統(tǒng)的共同點是都需要導向RNA，這些短RNA更易于設計。”

研究人員提出了新的解決方案：將導向RNA延伸多20個核苷酸，讓其自身折疊，變成原始導向RNA的“尾巴”，形成發(fā)夾形狀。如果DNA序列中有一個堿基不正確，這就會形成一種無法解開的鎖定，而由于導向RNA更傾向于與DNA結合，因此碰到正確組合的DNA，就能打開，靶向結合。

“我們能夠對這種‘鎖定’的強度進行微調(diào)，方便導向RNA在達到正確匹配時仍能正常工作，”Kocak說。

研究人員表示，這種方法可以將四種不同細菌菌株的五種不同CRISPR系統(tǒng)的編輯準確率（人體細胞切割的準確性）平均提高50倍。在其中一個案例中，甚至提高了200多倍。

“這是一個非常簡單的想法，Dewran多年來的工作表明它的工作方式與我們認為的相符，這是一個很好的解決方案，可以擺脫脫靶效應?！?/p>

下一步，研究人員希望能夠看到這種方法應用于多少種不同的CRISPR變體，并且深入探索鎖定機制的工作原理，CRISPR變體之間是否存在差異等。由于這些實驗是在培養(yǎng)的細胞中進行的，研究人員也迫切希望看到這種方法在實際動物疾病模型中是否能提高CRISPR的準確性。

來源：生物通

原文標題：

Increasing the Specificity of CRISPR Systems with Engineered RNA Secondary Structures