張鋒團隊今日再登《科學》,全新RNA編輯技術升級CRISPR工具包
今日凌晨,《科學》雜志發(fā)表麻省理工學院和哈佛大學 Broad 研究所張鋒團隊最新文章,他們開發(fā)的一種名為 RESCUE 的全新 CRISPR 基因編輯技術,可以進行以前不可能進行的 RNA 單堿基編輯。
具體而言,張鋒團隊利用 dCas13 引導 RESCUE 有針對性地靶向轉(zhuǎn)錄RNA中的胞嘧啶堿基(C),并使用一種改進后的全新 ADAR2 酶把不需要的胞嘧啶堿基(C)精確地修改為尿嘧啶堿基(U),從而改變 RNA 的指令,達到不修改 DNA 也可實現(xiàn)改變蛋白質(zhì)的目的。
RESCUE 極大擴展了 CRISPR 技術在 RNA 編輯領域的應用,包括蛋白質(zhì)中可修改的特定位置,比如磷酸化位點。這些位點在蛋白質(zhì)的功能中起著決定性的作用,在信號分子和癌癥相關通路中尤為明顯。
“為了治療引起疾病的基因變異多樣性,我們需要一系列精確的技術來選擇。通過開發(fā)這種新的酶,并將其與 CRISPR 的可編程性和精確性相結合,我們填補了 CRISPR 工具箱中的一個關鍵空白?!睆堜h教授表示。
越來越豐富的 CRISPR 工具包
真核生物的基因組由數(shù)十億個 DNA 堿基組成,精確靶向目的基因并修改這些 DNA 堿基序列,對整個分子生物學和醫(yī)學的發(fā)展都具有巨大價值。我們熟悉的通過病毒轉(zhuǎn)染將基因片段插入目的基因組,就是科學家們對于基因編輯最初的努力。但是,這樣的基因編輯方法,既耗時耗力,又難以精確實現(xiàn)預期目的。
30 多年前,科學家在細菌中發(fā)現(xiàn)一段規(guī)律間隔成簇短回文重復序列,并發(fā)現(xiàn)這種重復序列可讓細菌對病毒有免疫抗性。2001 年,西班牙科學家 Francisco Mojica 正式將其命名為 CRISPR。
2012年,兩位女科學家,來自加州大學伯克利分校的結構生物學家詹妮弗·杜德納(Jennifer Doudna)和瑞典于默奧大學的埃馬紐埃爾·卡彭蒂耶(Emmanuelle Charpentier)首次將 CRISPR/Cas 作為基因編輯系統(tǒng)應用。
之后,來自于哈佛大學醫(yī)學院的 George Church、麻省理工學院 Broad 研究所的張鋒以及加州大學舊金山分校系統(tǒng)及合成生物學中心的亓磊(目前就職于斯坦福大學),分別發(fā)表三篇文章,將 CRISPR/Cas 基因編輯系統(tǒng)首次成功應用到哺乳動物細胞中。
圖 | 張鋒教授(來源:麻省理工科技評論)
CRISPR/Cas 的出現(xiàn),引領了整個基因編輯領域爆炸式的發(fā)展,并徹底改變了我們修改疾病相關基因突變的能力。
而自 2012 年 CRISPR 基因組編輯工具正式出現(xiàn)以來,已發(fā)表了 9000 多篇相關的研究論文。眾多科學家不斷改進 CRISPR/Cas 基因編輯系統(tǒng),將其從單一的“基因剪刀”擴展成多功能的“基因工具包”,包括靶向 DNA 的 Cas9 和 Cas12 酶,靶向 RNA 的 Cas13 酶。不斷豐富的 CRISPR/Cas 系統(tǒng)也展現(xiàn)出令人興奮的廣闊應用前景。
但是,對 DNA 的編輯修改,意味著對基因組不可逆的永久性改變,這一過程也目前面臨著不可回避的安全風險和倫理問題。此外,一些細胞類型,比如神經(jīng)元,很難使用 CRISPR/cas9 介導的編輯對 DNA 進行修改,這也就限制了神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基因治療應用。
于是,一種僅編輯修改 RNA 的基因編輯策略被科學家們提了出來。
DNA 是遺傳信息的載體,RNA 作為 DNA 轉(zhuǎn)錄出來的中間產(chǎn)物,負責指導下游蛋白質(zhì)的生產(chǎn)。因此,針對與疾病相關的基因突變,僅短暫對 RNA 突變進行修改,既避免了對基因組的不可逆修改,又實現(xiàn)了突變蛋白質(zhì)的糾正。
全新的 RESCUE 系統(tǒng)
2017 年,張鋒團隊就在《科學》雜志發(fā)表了一項針對 RNA 編輯的全新 CRISPR 系統(tǒng)——REPAIR,在這款RNA編輯器中,研究人員將高效靶向 RNA 的 Cas13b 蛋白與 ADAR2 酶結合在一起,將 REPAIR 編輯系統(tǒng)引導至特定的 RNA 位置,特異性地將 RNA 上的腺嘌呤堿基(A)修改為與鳥嘌呤堿基(G)結構類似的肌苷(I)。
對于細胞而言,肌苷與鳥嘌呤堿基十分相像,能夠以鳥嘌呤的身份合成具有正常生理功能的蛋白質(zhì)。因此,REPAIR 編輯系統(tǒng)相當于實現(xiàn)了有效地對 RNA 中的腺嘌呤(A)進行單堿基編輯。
通過對 REPAIR 編輯系統(tǒng)的改進升級而來的全新 RESCUE 編輯系統(tǒng),能夠?qū)崿F(xiàn)直接將 RNA 中的胞嘧啶堿基(C)直接修改為尿嘧啶堿基(U)。RESCUE 編輯系統(tǒng)能夠被引導到到任何 RNA 中,然后通過優(yōu)化的 ADAR2 組件平臺執(zhí)行由 C 到 U 的 RNA 編輯任務。
圖 | 由堿基 C 到堿基 U,和由堿基 A 到 I 的原理圖(來源:Science)
在最新發(fā)表的論文中,研究人員還將這個新平臺應用到人類細胞中,與實驗室中合成 RNA 中有效修改 24 個臨床相關突變一樣,RESCUE 編輯系統(tǒng)成功靶向了人類細胞中的天然 RNA。
研究人員表示,接下來他們將進一步優(yōu)化 RESCUE 編輯系統(tǒng),以減少目標外的編輯,同時最小化目標內(nèi)編輯的干擾。
RESCUE 編輯系統(tǒng)的誕生,意味著翻譯后修飾調(diào)控許多蛋白質(zhì)活性和功能的位點,如磷酸化、糖基化和甲基化,現(xiàn)在可以更容易地成為編輯的目標。
為了驗證 RESCUE 編輯系統(tǒng)的這種應用潛力,研究人員在人類細胞實驗中證實,RESCUE 編輯系統(tǒng)可以精準靶向編碼 β-catenin 蛋白(β-catenin 蛋白已知在蛋白質(zhì)磷酸化過程中發(fā)揮關鍵作用)的 RNA 特殊位點,引起 β-catenin 蛋白活性的臨時增加,并促進細胞生長。
如果這樣的變化是永久性的,它可能會使細胞不受控制地生長進而發(fā)展為癌癥。但現(xiàn)在通過使用 RESCUE 編輯系統(tǒng),短暫的細胞生長可以實現(xiàn)促進傷口愈合,應對急性損傷。
圖 | 在 RESCUE 編輯系統(tǒng)中,酶 Cas13(粉紅色)使用向?qū)Вt色)來定位細胞中的 RNA(藍色)(來源:Stephen Dixon)
此外,研究人員還將目光瞄準了一種致病基因變體?APOE4。APOE4?等位基因一直是晚發(fā)性阿爾茨海默病發(fā)病的遺傳風險因素,與?APOE4?只有兩個堿基區(qū)別的?APOE2(APOE4?中的兩個堿基 C,對應著?APOE2?中的兩個堿基 U),卻不是阿爾茨海默病的危險因素。
于是,張鋒團隊將與疾病風險相關的?APOE4?RNA 進入細胞中,通過 RESCUE 編輯系統(tǒng)成功將?APOE4?中的兩個堿基C,修改為?APOE2?序列,這本質(zhì)上相當于能夠?qū)y帶APOE4?基因的阿爾茨海默病高風險人群,風險轉(zhuǎn)化為無。
為了將 RESCUE 編輯系統(tǒng)作為一種廣泛使用的工具,更好地推向臨床應用,張鋒實驗室計劃將 RESCUE 編輯系統(tǒng)向?qū)W術界免費共享,在此之前,他們開發(fā)的 CRISPR 工具,也都向用于學術研究的科學家們免費共享。
來源:MIT科技評論

