線粒體DNA（mtDNA）突變可導(dǎo)致人類一系列無(wú)法治愈的代謝疾病。這類疾病最常在母體傳播，并損害細(xì)胞產(chǎn)生能量的能力。盡管與基因組相比，線粒體基因組中的基因數(shù)量很少，但這些突變會(huì)為遺傳這些基因的人帶來(lái)致命的影響。

但是研究這類疾病一直很困難，因?yàn)榭茖W(xué)家們?nèi)狈σ环N方法來(lái)制作線粒體基因組具有相同突變的動(dòng)物模型。因此，開(kāi)發(fā)出一種可以編輯mtDNA的工具是線粒體遺傳學(xué)科學(xué)家們長(zhǎng)期奮斗的目標(biāo)。

圖片來(lái)源：CNRI/SPL

那么，為什么不用“魔剪”CRISPR-Cas9？因?yàn)镃RISPR-Cas9幾乎可以對(duì)任何生物體中的基因進(jìn)行編輯。該工具使用的RNA鏈可以將Cas9酶引導(dǎo)科學(xué)家想要編輯的DNA區(qū)域。問(wèn)題來(lái)了，這對(duì)于細(xì)胞核中的DNA效果很好，但是RNA無(wú)法穿入被膜包圍的線粒體。面對(duì)線粒體，“魔剪”似乎有點(diǎn)束手無(wú)策。

2018年底，美國(guó)Broad研究所David Liu（劉如謙）了解到，華盛頓大學(xué)微生物學(xué)家Joseph Mougous帶領(lǐng)團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)“奇怪”的酶。它是由細(xì)菌伯克霍爾德氏菌（Burkholderia cenocepacia）產(chǎn)生的一種毒素（DddA），當(dāng)它遇到DNA胞嘧啶（C）時(shí)，便將其轉(zhuǎn)化為尿嘧啶（U）。由于在DNA中不常見(jiàn)的U就類似于T，因此可以復(fù)制細(xì)胞DNA的酶。將其復(fù)制為T，從而有效地將基因組序列中的C轉(zhuǎn)換為T。

David Liu此前在堿基編輯中也利用了類似的酶，但是這些酶通常只作用于單鏈DNA。Liu必須依靠Cas9酶來(lái)破壞雙鏈DNA并創(chuàng)建一個(gè)未纏繞的單鏈DNA區(qū)域，使得這種酶起作用。由于它依賴于指導(dǎo)Cas9的RNA鏈，因此該技術(shù)無(wú)法到達(dá)線粒體基因組。

但是，Mougous研究小組發(fā)現(xiàn)的DddA可以直接作用于雙鏈DNA，而無(wú)需依靠Cas9酶來(lái)破壞它。Liu和Mougous一拍即合—— DddA可以和非CRISPR的DNA定位系統(tǒng)配對(duì)，實(shí)現(xiàn)線粒體基因組編輯。相關(guān)研究結(jié)果于7月8日發(fā)表在《Nature》雜志上。

當(dāng)然，為了讓DddA用于線粒體基因組編輯，Liu和Mougous也克服了重重挑戰(zhàn)。首先，DddA對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞是有毒的。為此，研究人員將DddA的毒素區(qū)域一分為二（split-DddAtox halves），變成兩個(gè)沒(méi)有活性的片段。接著將這兩片段分別與TALE蛋白融合，并使其與特定的DNA序列結(jié)合，只有當(dāng)它們到達(dá)特定位點(diǎn)后相遇才激活。最后，想要將這一基因編輯工具遞送到線粒體基質(zhì)中，它們必須要穿過(guò)線粒體的雙層膜。因此，研究團(tuán)隊(duì)使用線粒體靶向信號(hào)的氨基酸序列標(biāo)記了構(gòu)建的基因編輯工具。對(duì)于線粒體雙層膜來(lái)說(shuō)，這一基于蛋白的導(dǎo)入機(jī)制比基于RNA的導(dǎo)入系統(tǒng)（如CRISPR-Cas9）更具優(yōu)勢(shì)。

最終，這就構(gòu)建了由DddA衍生的不依賴CRISPR的線粒體堿基編輯器（DdCBE），能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)線粒體基因組的精準(zhǔn)編輯，為研究和治療線粒體相關(guān)疾病帶來(lái)新的工具。

所有基因組編輯工具都需要考慮脫靶效應(yīng)。研究小組比較了處理過(guò)的細(xì)胞和未處理過(guò)的細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)核基因組中沒(méi)有偏離靶點(diǎn)的影響。mtDNA的脫靶活性較低。接下來(lái)，研究小組研究了DdCBE的治療潛力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其可以修復(fù)已知49%的有害mtDNA突變。

DdCBE可以減少攜帶mtDNA突變的比例，而不減少拷貝數(shù)。因此，當(dāng)線粒體突變負(fù)荷很高時(shí)，它可能是首選甚至是唯一的選擇。

Liu強(qiáng)調(diào)，這項(xiàng)研究距離在臨床上使用還有很長(zhǎng)的路要走。盡管初步研究發(fā)現(xiàn)脫靶DNA的改變很少，但仍需要對(duì)不同細(xì)胞類型進(jìn)行更多的研究。

《Nature》雜志評(píng)價(jià)說(shuō)，該研究成果是開(kāi)發(fā)針對(duì)mtDNA疾病的基因療法的重要進(jìn)展。此外，通過(guò)使用該工具實(shí)驗(yàn)性地改變線粒體基因組，可以更好地了解mtDNA突變與復(fù)雜疾病、癌癥和年齡相關(guān)的細(xì)胞功能障礙的相關(guān)性。