疾病的發(fā)生發(fā)展通常與細胞內(nèi)信號網(wǎng)絡異常相關，利用藥物靶向調(diào)節(jié)相應的關鍵分子或功能途徑進行干預是基礎研究和臨床治療的重要手段。傳統(tǒng)小分子藥物的作用靶標必須具備特殊的“疏水口袋”，導致僅有部分（20%）靶標蛋白可用于小分子藥物的研究，相比之下生物大分子藥物（如蛋白質(zhì)、抗體、核酸等）在識別的靶分子類型上幾乎沒有限制，并且在靶向特異性及藥效上也獨具優(yōu)勢，這使其成為藥物研發(fā)最具前景而又競爭激烈的領域之一。目前的生物大分子藥物主要是針對胞外或膜上靶標，然而，70%的藥物潛在靶標是位于細胞內(nèi)部的，細胞膜的選擇通透性導致生物大分子難以企及這個巨大的藥物寶庫。因此，如何有效地將生物大分子遞送到細胞內(nèi)部成為生物大分子治療以及基礎生物學研究的當務之急。細胞穿膜肽（Cell penetrating peptides, CPPs），可介導生物大分子入胞，并且具有生物相容性高、操作簡便、毒副作用低等優(yōu)勢，是目前生物大分子遞送領域的研究熱點之一。但是，CPPs仍面臨著遞送效率低以及體內(nèi)應用時血清耐受性差等問題，這也導致在開展CPPs研究后的三十多年間，還未有基于CPPs的臨床藥物獲批上市。夏寧邵團隊提出了一種新型的嵌合多肽生物大分子入胞遞送系統(tǒng)，克服了上述CPPs在應用中的瓶頸，并將其成功用于小鼠急性肝損傷體內(nèi)治療模型中。

該研究團隊首先著力于解決CPPs遞送效率低的問題，尤其是內(nèi)吞小泡逃逸效率低的問題（90%-99%的CPPs無法從內(nèi)吞小泡中逃逸，導致其最終在溶酶體中降解（圖.1a））。此前，有研究顯示pH敏感肽的酸化變構(gòu)可破壞內(nèi)吞小泡囊膜，因此常被用于提升CPPs的內(nèi)吞小泡逃逸效率，但由于CPPs、pH敏感肽與囊膜之間較強的粘附作用，被轉(zhuǎn)運的蛋白貨物分子大部分仍無法從內(nèi)吞小泡中成功逃逸（圖.1b）。該團隊從研究最為深入的細胞穿膜肽TAT入手，在TAT+pH敏感肽（INF7）基礎上，創(chuàng)新性地引入內(nèi)吞小泡特異性蛋白酶酶切位點，利用內(nèi)吞小泡內(nèi)蛋白酶的酶切作用，促使貨物分子與遞送系統(tǒng)分離，從而有效地提高了內(nèi)吞小泡逃逸效率（例如以GFP為貨物分子時，內(nèi)吞小泡逃逸效率可提高4～5倍）（圖.1c）。另一方面，血清耐受性差嚴重影響著CPPs系統(tǒng)的體內(nèi)應用。研究人員發(fā)現(xiàn)血清中大量的帶有負電性的蛋白（如白蛋白）會與帶有正電荷的CPPs結(jié)合，從而影響CPPs與細胞膜接觸，最終抑制CPPs的遞送。該研究團隊引入多聚化結(jié)構(gòu)域（如亮氨酸拉鏈，Leu-zipper）形成多價CPPs系統(tǒng)，克服了血清中的主要成分白蛋白對遞送過程的影響，在一定程度上解決了血清耐受性差的問題（圖.1e）。最終，將上述兩種策略聯(lián)用構(gòu)建的嵌合肽eTAT（enhanced TAT）遞送系統(tǒng)，同時擁有高效的遞送效率（例如eTAT介導的GFP入胞效率相較于TAT介導提高了12倍）以及良好的血清耐受程度，展現(xiàn)出其在體內(nèi)的應用潛力（圖.1d）。

圖1. eTAT與其它基于TAT的遞送系統(tǒng)的比較

隨后，該研究團隊以細胞內(nèi)介導細胞壞死途徑的RIP3蛋白為藥物靶標，將eTAT系統(tǒng)與功能性蛋白Ppm1b融合表達組成治療性分子eTAT-Ppm1b，用于小鼠急性肝損傷的治療。APAP（對乙酰氨基酚，泰諾^?）是目前世界范圍內(nèi)最常用的解熱鎮(zhèn)痛藥物，但其過量使用會通過RIP3介導的壞死性凋亡途徑引起急性肝臟損傷甚至死亡。此前，有研究顯示Ppm1b可使位于胞內(nèi)靶標RIP3去磷酸化從而阻斷壞死性凋亡途徑。該研究團隊將eTAT-Ppm1b重組蛋白尾靜脈注射小鼠，結(jié)果顯示eTAT-Ppm1b將APAP導致的小鼠死亡率從100%降至40%，效果顯著優(yōu)于目前FDA批準的唯一一款針對該疾病的藥物NAC（死亡率80 %）。

eTAT作為一種通用型的遞送系統(tǒng)，只需與不同的功能蛋白質(zhì)結(jié)合，即可實現(xiàn)相應胞內(nèi)靶標的干預及功能調(diào)節(jié)，達到治療相關疾病的目的。例如，eTAT系統(tǒng)與核酸結(jié)合蛋白融合，可介導mRNA、DNA形式的生物大分子入胞并表達，從而補充功能喪失或在生理水平上表達缺陷的基因或者誘導機體產(chǎn)生相應的免疫應答，同時也可介導小干擾RNA（siRNA）入胞實現(xiàn)疾病相關基因表達的下調(diào)；eTAT與基因編輯工程酶（如CRISPR/Cas9）結(jié)合，實現(xiàn)對疾病相關基因的操縱以達到治療效果?？傊?，該研究不僅為生物大分子的胞內(nèi)遞送提供新的策略，而且為針對胞內(nèi)靶標的蛋白藥物的基礎研究和臨床應用奠定基礎。

近日，相關研究成果以題為“Efficient intracellular delivery of proteins by a multifunctional chimaeric peptide in vitro and in vivo”的論文在線發(fā)表于《自然?通訊》（Nature Communications）。博士生于思遠、博士生楊晗、高級工程師李廷棟、博士生潘海峰為該論文的共同第一作者。夏寧邵教授、葛勝祥教授、袁權教授為該論文的共同通訊作者。該研究獲得科技部國家重點研發(fā)計劃、福建省自然科學基金重點項目、國家自然科學基金的資助。

論文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-021-25448-z

來源：廈門大學